巴尔通体探针RPA特异性引物组合物、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种巴尔通体的RPA特异性引物对Ⅰ和引物对Ⅱ、检测试剂盒和检测方法，本发明专利技术所建立的探针重组酶聚合酶扩增技术诊断方法能有效检测虫媒传染病巴尔通体的特异性基因，其最低检测限质粒模板浓度达到102copies/μl；各病原体间无交叉反应，特异性好；检测精密度小于5％，可重复性好。该技术能够实现虫媒传染病巴尔通体现场快速检测，丰富了虫媒传染病的检测手段，不仅可为现场检测提供技术手段，也为国境口岸疾病监测提供了技术支持。也为国境口岸疾病监测提供了技术支持。也为国境口岸疾病监测提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
巴尔通体探针RPA特异性引物组合物、检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及一种巴尔通体探针RPA特异性引物组合物、检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]现有口岸荧光定量PCR等检测技术对虫媒传染病的检测时间长，难以快速的发现虫媒传染病，像大型会场现场这种需要快速检测，确保运动员顺利参加赛事的场景，缺乏可快速得到检测结果的检测试剂盒。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中缺少快速检测虫媒传染病的试剂盒的缺陷，提供一种基于重组酶聚合酶扩增的探针重组酶聚合酶扩增技术，应用于虫媒传染病巴尔通体的快速分子检测并研发成试剂盒。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
[0005]重组酶聚合酶扩增技术包括3种关键组分，分别是重组酶(如 T4 uvsX、E.coli recA等)、单链结合蛋白(如T4 gp32等)和链置换DNA聚合酶(如B.subtilis Pol I、S.aureus Pol等)。
[0006]重组酶聚合酶扩增技术的原理，如下：
[0007](1)重组酶与长约30
‑
35nt的引物结合形成的复合物在双链DNA模板中寻找靶位点；
[0008](2)复合物在模板上定位后可以直接引发链交换反应形成D
‑
Loop结构，单链结合蛋白随即结合被置换的DNA链，稳定形成的D
‑
Loop结构并且防止引物解离；
[0009](3)重组酶<br/>‑
引物复合物主动水解体系中的ATP导致复合物构象改变，重组酶解离后引物3'端暴露并被DNA聚合酶识别，DNA聚合酶按照模板序列在引物3'末端添加相应碱基，DNA
[0010]扩增启动；
[0011](4)链置换DNA聚合酶在延伸引物的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构，DNA合成过程继续进行；
[0012](5)两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子。
[0013]重组酶聚合酶扩增体系中还含有T4 uvsY和Carbowax20M等成分，可以改变重组酶
‑
引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于重组酶聚合酶扩增的进行。同时，重组酶聚合酶扩增体系中可以加入反转录酶将RNA作为模板合成DNA后再进行扩增，使重组酶聚合酶扩增可以同时应用于RNA的检测。按照上述体系建立的重组酶聚合酶扩增反应体系一般称为基础型RPA方法。在基础型 RPA的基础上，Piepenburg等利用序列特异性荧光探针建立了可以实时监测荧光信号判断产物扩增情况的探针法RPA以及可以直接肉眼观察最终扩增结果的侧流层析试纸条RPA(lateral flow RPA， LF
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RPA)。
[0014]本专利技术针对巴尔通体采用探针法RPA。与基础型RPA的反应体系相比，探针法RPA体
系中一般含有核酸外切酶Ⅲ(exonuclease
ꢀⅢ
，即exo)和exo荧光探针(根据酶的名称命名为exo探针)，通过检测荧光信号实时监测重组酶聚合酶扩增产物的扩增情况。exo探针含有一个碱基模拟物四氢呋喃分子(tetrahydrofuran，THF)，THF分子两侧分别带有荧光基团和淬灭基团，探针3'端带有防止探针延伸的阻断物。当探针与靶DNA结合形成双链杂合DNA结构后，exoⅢ作为一种DNA修复酶，识别THF位点并切割探针使荧光基团和淬灭基团分离从而产生荧光。用exo探针的重组酶聚合酶扩增反应一般使用可以实时收集荧光信号的装置(如荧光定量PCR仪、ESEQuant TubeScanner device、等)监测反应情况。此外，exo探针法RPA 反应速度更快，一般在20min内即可完成检测，灵敏度和特异性均很高。
[0015]在经过Blast、Bioedit、Primer Express及Multiple PrimerAnalyzer对各引物和探针的特异性进行初步分析和验证的基础上，进一步对所设计的各引物和探针进行目标重组质粒DNA的稀释梯度标准品进行检测，通过检测结果评价各引物和探针的性能，进而筛选出最优的引物探针进行后续实验。
[0016]本专利技术的探针引物序列(两对)如下表所示：
[0017][0018][0019]本专利技术所建立的探针重组酶聚合酶扩增技术诊断方法能有效检测虫媒传染病巴尔通体的特异性基因，其最低检测限质粒模板浓度达到102copies/μl；各病原体间无交叉反应，特异性好；两组引物的检测精密度小于5％，两组引物混合使用检测可重复性好。该技术能够实现虫媒传染病巴尔通体现场快速检测，丰富了虫媒传染病的检测手段，不仅可为会场现场检测提供技术手段，也为国境口岸疾病监测提供了技术支持。
附图说明
[0020]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实
施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0021]图1是特异性分析扩增效果；
[0022]图2是精密度分析扩增效果。
具体实施方式
[0023]以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0024]实施例
[0025]在经过Blast、Bioedit、Primer Express及Multiple PrimerAnalyzer对各引物和探针的特异性进行初步分析和验证的基础上，进一步对所设计的各引物和探针进行目标重组质粒DNA的稀释梯度标准品进行检测，通过检测结果评价各引物和探针的性能，进而筛选出最优的引物探针进行后续实验。
[0026]引物与探针的成品均为干粉状。对于干粉状的引物和探针，先离心10min，使粉末沉到管底，加入TE缓冲溶液，将其稀释为 100μmol/l，漩涡震荡混匀，
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20℃保存，作为保存液，需使用时再稀释为工作液。引物、探针的工作液浓度为10μmol/l，按照5μl 保存液+TE缓冲溶液的比例进行稀释即可，稀释后的引物探针分别进行分装备用。
[0027]重组质粒DNA保存于
‑
80℃冰箱，每次使用前，先使用TE缓冲液进行10梯度稀释，制备浓度为106～101copies/μl的标准品，以标准品作为模板进行重组酶聚合酶扩增技术检测。对于病原体探针重组酶聚合酶扩增技术反应体系的配制，为了减小实验误差，统一配制基础液。以浓度为106～101copies/μl的标准品作为阳性对照，以RNase Free dH2O作为阴性对照，每个样本设置3个平行样。每个反应液依次分别加入10μl浓度为101copies/μl， 102copies/μl，103copies/μl，104copies/μl，105copies/μl， 106copies/μl的重组质粒DNA。
[0028]通过各引物探针检测不同浓度梯度的标准品的扩增曲线分析，以及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
ID No .3；所述引物对Ⅱ的序列为：F：TTGATGCRACVCGTATTGTTATTCGTGCRA，SEQ ID No .4；R：GAACGCTGAAATTTYTGYAARCGATAAATA，SEQ ID No .5；P：TATTGTTATTCGTGCRACAGARGAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫冀焕，史玲莉，沈军，贾兆强，李云，慈颖，田洁，李磊，李文杰，李君萍，
申请(专利权)人：河北国际旅行卫生保健中心石家庄海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：