核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法和应用技术

本发明专利技术涉及重组酶介导的核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法和应用。通过RAA恒温扩增微生物基因组DNA，得到带有T7启动子的DNA产物，称为T7

【技术实现步骤摘要】
核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法和应用


[0001]本专利技术属于病原微生物和食源性病原检测生物
，是一种基于重组酶介导的核酸等温扩增技术(RAA)和CRISPR/Cas13a技术联合应用，快速特异检测微生物的方法和应用。

技术介绍

[0002]1983年Kary Mullis专利技术了聚合酶链式反应(PCR)，使扩增和克隆DNA成为一个常规操作程序。体外DNA扩增技术也因此迅猛发展，实时定量PCR、免疫PCR等技术相继问世。但由于热循环的需要，这些技术都依赖于较为昂贵的PCR仪，限制了其在基层实验室或现场应用。为解决上述缺点，等温核酸扩增技术悄然兴起。重组酶介导核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)，是由众测生物公司专利技术的一种在等温条件下的核酸快速扩增技术。在37
‑
42℃等温条件下，利用从细菌获得的recA重组酶与引物DNA紧密结合形成聚合体。当引物与靶DNA完全互补配对时，在单链DNA结合蛋白(SSB)的帮助下，重组酶解开靶DNA的双螺旋结构进行链置换，随后Bsu DNA聚合酶对链置换后的DNA进行延伸，在30min内即可使扩增产物指数级增长。基于上述原理，仅需一台等温仪研究人员即可对核酸模板进行快速扩增，极大地简化了检测条件，促进了快速诊断技术的发展。
[0003]CRISPR/Cas(规律间隔成簇短回文重复序列及其关联基因)系统是存在于细菌及古细菌中一种用于抵御噬菌体入侵的天然免疫系统。当外来噬菌体入侵时，细菌能够生成用于识别病毒基因组的crRNA，与具有核酸内切酶活性的Cas蛋白结合形成复合体，共同对病毒靶序列进行识别和切割。该系统近些年在基因编辑领域崭露头角，其基因编辑能力给生物学界带来了新的革命。自2015年张锋团队发现C2C2(Cas13a)蛋白以来，CRISPR/Cas13系统备受关注。该系统具有特异性靶向单链RNA和附属非特异性切割单链RNA等特点，其出色的靶向效率和特异酶切能力使其在核酸快速检测方面具有良好的应用前景。
[0004]随着时代发展，食源性微生物已经成为威胁公众健康和经济发展的一个重要因素。据统计，每年有约15亿人感染食源性疾病。据WHO报告，沙门氏菌是全球食物中毒和腹泻样本中最为常见的病原体之一，在食源性病原菌中位列第一。沙门氏菌属于肠杆菌科中的一类革兰氏阴性杆菌，在自然界中广泛存在，对人类和动物健康具有很大危害。感染沙门氏菌的动物会出现腹泻、肠胃炎和败血症等症状，母畜感染则容易流产，而人感染则易出现高热、呕吐和严重腹泻等急性肠胃炎症状。因此，建立一种快速检测食源性微生物尤其是沙门氏菌的方法和应用对公共卫生和畜禽养殖具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于：克服当前微生物检测技术需要贵重仪器和不能在基层实验室应用的不足，提供一种基于重组酶介导的核酸等温扩增(Recombinase Aided Amplification，RAA)以及T7转录和CRISPR/Cas13a联合反应的简便、快速检测微生物的方
法和应用，该方法通过RAA和合并T7转录
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CRISPR/Cas13a检测两步，30min即可完成微生物(如沙门氏菌)DNA样品的特异检测，且只需普通金属浴和便携式荧光检测仪，不需要荧光定量PCR仪。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]一种基于RAA核酸等温扩增和T7转录
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CRISPR/Cas13a联合快速检测微生物的方法，所述方法通过RAA等温扩增目标细菌DNA样品，得到带有T7启动子的DNA产物，称为T7
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DNA，即目标DNA；然后合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测，利用Cas13a
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crRNA复合物检测T7
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DNA转录后得到的目标细菌的靶标RNA。
[0008]具体原理为：当T7
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DNA转录得到的目标RNA存在crRNA识别位点时，Cas13a/crRNA复合物识别并结合靶标RNA，同时激活Cas13a附属切割功能，随机切割周围无关单链RNA；通过在此单链RNA两端分别修饰荧光基团FAM(即荧光报告分子)和淬灭基团BHQ1，Cas13a切割后使荧光基团FAM远离淬灭基团BHQ1，破坏了BHQ1淬灭功能，使得检测体系中的FAM产生荧光信号，根据荧光信号强度，确定是否存在靶标RNA和目标细菌。
[0009]该技术方案的步骤如下：
[0010](1)筛选特异靶基因，设计并制备crRNA；
[0011](2)利用试剂盒提取样品中微生物的基因组DNA；
[0012](3)对微生物特异性基因进行RAA等温扩增，获得T7
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DNA；
[0013](4)合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测。
[0014]需要指出的是，所述T7转录方式为体外转录；所述合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测是指混合转录体系和CRISPR/Cas13a检测体系的组分，于等温条件下共同反应，以简化操作流程，缩短检测时间；所述温度均为38℃。
[0015]基于上述方案和原理，可以通过设计特异性RAA等温扩增引物和crRNA，利用引物和crRNA的双特异性，达到特异且快速检测目标微生物的目的。
[0016]特别地，所述微生物为沙门氏菌；所述特异性基因为invA基因。
[0017]优选地，所述荧光报告分子核苷酸序列为：FAM
‑
UUUUUU
‑
BHQ1；
[0018]优选地，所述RAA等温扩增的上游引物携带T7启动子，引物序列为：5
’‑
TAATACGACTCACTATAGGTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGT
‑3’
；RAA等温扩增的下游引物核苷酸序列为：5
’‑
CTCATTAATCAACAATACGATGCTGTTATC
‑3’
。
[0019]优选地，所述crRNA核苷酸序列为：5
’‑
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCGCACGCCAUAAUCAAUAAA
‑3’
；
[0020]优选地，所述靶标RNA序列为：5
’‑
UUUAUUGAUUAUGGCGUGCG
‑3’
；
[0021]优选地，所述T7
‑
DNA核苷酸序列为：5
’‑
TAATACGACTCACTATAGGTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTAGGACTGATTGGCGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法，设计并合成目标微生物DNA片段的特异性扩增引物和特异性crRNA；对微生物特异性基因进行重组酶介导的核酸等温扩增，得到带有T7启动子的特异性DNA片段T7
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DNA；然后合并进行T7 RNA聚合酶转录和CRISPR/Cas13a
‑
crRNA酶切反应，当crRNA识别T7
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DNA转录得到的靶标RNA时，CRISPR/Cas13a
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crRNA复合物识别并结合目标RNA，同时激活Cas13a附属切割功能，随机切割周围无关单链RNA；通过在无关单链RNA两端分别修饰荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1，Cas13a切割后使荧光基团FAM远离淬灭基团BHQ1而发出荧光信号，进行荧光信号采集。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸等温扩增反应温度为37
‑
39℃。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述T7转录方式为体外转录；所述合并进行T7聚合酶转录和CRISPR/Cas13a检测是指混合转录体系和CRISPR/Cas13a检测体系的组分，于37
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39℃等温条件下共同反应，反应结束后于荧光检测仪中读取FAM荧光强度，与阴性组对比并得出检测结论。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：荧光报告分子核苷酸序列为：FAM
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UUUUUU
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BHQ1。5.根据权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：方维焕，付豪，李肖梁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：