一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及环境和基因检测技术领域，尤其是涉及一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法及其应用。方法包含环境样品基因组DNA的提取；目的基因的特异性引物及其扩增；将目的基因片段与pEASY

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及环境和基因检测
，尤其是涉及一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法及其应用。

技术介绍

[0002]抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)是使细菌产生抗生素耐药性的功能基因，可通过多种直接或间接的传播转移途径在环境介质中广泛传播，同时在传播过程中造成多种抗性菌甚至“超级细菌”的出现，进而加速抗生素抗性的传播和增强，严重威胁人类健康和生态系统稳定。抗性基因污染已被联合国卫生组织列为21世纪新型三大污染问题之一。因此，新型抗生素抗性基因的分析检测，对环境中ARGs污染水平评估和削减治理具有重要的现实意义。
[0003]氯霉素曾被广泛的应用于畜牧和水产养殖业的病害防治，但因其具有较强的毒副作用而逐渐被禁止在兽医临床和食品动物中的使用。有研究表明，环境中的氯霉素残留对氯霉素抗性的产生具有显著相关性，且ARGs可通过水平基因转移的方式在不同细菌之间进行传播，进而导致其在环境中的残留更加持久。然而，在面对不同环境中的选择压力，比如多重抗生素胁迫，微生物可能会在现有的抗性基础上衍生出一些新型抗性基因，以应对一种或者多种选择压力。目前现有的新型ARGs检测技术主要是依赖于纯培养技术和高通量测序技术等方式。虽然纯培养技术能够实现对新型ARGs的准确定性分析，但该方法验证周期长，操作较为复杂，然而无法实现对不可培养微生物及环境样品进行高通量检测；高通量测序技术则依赖于现有数据库的完整性，无法及时检测新型抗性基因的赋存情况，并且检测周期较长，价格昂贵。因此，需要开发一种简便快速且灵敏度较高的方法来对不同环境样品中新型氯霉素抗性基因进行快速检测。

技术实现思路

[0004]为了解决上述
技术介绍
中所提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法及其应用，该方法操作简单易行，灵敏度较高，检测周期短，且可同时对不同环境样品中新型氯霉素抗性基因进行快速定量检测。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一方面，本专利技术提供了一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，包括以下步骤：
[0006](1)环境样品的预处理以及基因组DNA的提取；
[0007](2)目的基因的扩增；
[0008](3)标准质粒的构建；
[0009](4)Q
‑
PCR标准曲线的构建；
[0010](5)环境样品中新型氯霉素抗性基因的定量检测。
[0011]进一步地，步骤(1)中所述环境样品的预处理为：将采集得到的环境样品经6000
‑
8000rpm，4℃离心5
‑
10分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置
‑
80℃保存。
[0012]进一步地，步骤(2)中所述目的基因的扩增具体为：根据新型氯霉素抗性基因的核酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物对；分别以环境样品基因组DNA和ddH2O为模板进行目的基因PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒将目的基因片段纯化回收和测序。
[0013]进一步地，步骤(3)中所述标准质粒的构建具体为：将步骤(2)中纯化后的目的基因片段与载体连接，转化至感受态细胞中，挑选单克隆使用通用引物对M13F/M13R进行菌落PCR验证阳性克隆。
[0014]进一步地，步骤(4)中所述Q
‑
PCR标准曲线的构建具体为：将步骤(3)中阳性克隆的PCR产物进行胶回收纯化，测定回收产物中DNA浓度，计算回收产物中DNA的拷贝数；随后对回收产物中DNA进行10倍梯度稀释，分别将稀释产物作为模板进行Q
‑
PCR，构建相应的标准曲线。
[0015]进一步地，步骤(5)中所述环境样品中新型氯霉素抗性基因的定量检测具体为：将环境样品的基因组DNA作为模板进行Q
‑
PCR，其与步骤(4)中Q
‑
PCR技术的体系和程序相同；根据步骤(4)中构建的Q
‑
PCR标准曲线，对环境样品中新型氯霉素抗性基因的拷贝数进行定量。
[0016]进一步地，当新型氯霉素抗性基因的核酸序列为SEQ ID NO：1时，包括以下步骤：
[0017](1)环境样品的预处理以及基因组DNA的提取：将采集得到的环境样品经8000rpm，4℃离心10分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置
‑
80℃保存；基因组DNA的提取采用FastDNA
TM Spin Kit(MP Biomedicals,USA)试剂盒，具体步骤参照试剂盒使用说明；
[0018](2)目的基因的扩增：根据新型氯霉素抗性基因的核酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物对，目的片段大小为394bp，引物序列如下：
[0019]P2
‑
F：5
’‑
ACAAGGGTTGGCGACATTCA
‑3’
SEQ ID NO：2，
[0020]P2
‑
R：5
’‑
TGCTTGACTATCCTGGCGAC
‑3’
SEQ ID NO：3；
[0021]分别以环境样品基因组DNA和ddH2O为模板进行目的基因PCR扩增，PCR扩增反应体系总体积为50μl，具体为25μl 2
×
SYBR Green Pro Taq HS Mix，10μM P2
‑
F和P2
‑
R各2μl，DNA模板1μl，ddH2O 20μl；反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，16℃保温；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒将目的基因片段纯化回收和测序；
[0022](3)标准质粒的构建：将步骤(2)中纯化后的目的基因片段与pEASY
‑
T1载体在37℃连接5分钟，随后将5μl连接产物加至50μl感受态细胞(Escherichia coli DH5α)中，冰浴20分钟；42℃热激30秒，再冰浴2分钟，加入250μl LB液体培养基，37℃、150rpm条件下培养1小时后；吸取80μl培养物涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，用封口膜封口后于37℃倒置培养过夜；挑选单克隆使用通用引物对M13F/M13R进行菌落PCR验证阳性克隆；
[0023](4)Q
‑
PCR标准曲线的构建：将步骤(3)中阳性克隆的PCR产物进行胶回收纯化，测定回收产物中DNA浓度，计算回收产物中DNA的拷贝数；随后对回收产物中DNA进行10倍梯度稀释，分别将稀释产物作为模板进行Q
‑
PCR，构建相应的标准曲线，Q本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)环境样品的预处理以及基因组DNA的提取；(2)目的基因的扩增；(3)标准质粒的构建；(4)Q
‑
PCR标准曲线的构建；(5)环境样品中新型氯霉素抗性基因的定量检测。2.根据权利要求1所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(1)中所述环境样品的预处理为：将采集得到的环境样品经6000
‑
8000rpm，4℃离心5
‑
10分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置
‑
80℃保存。3.根据权利要求1所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(2)中所述目的基因的扩增具体为：根据新型氯霉素抗性基因的核酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物对；分别以环境样品基因组DNA和ddH2O为模板进行目的基因PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒将目的基因片段纯化回收和测序。4.根据权利要求3所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(3)中所述标准质粒的构建具体为：将步骤(2)中纯化后的目的基因片段与载体连接，转化至感受态细胞中，挑选单克隆使用通用引物对M13F/M13R进行菌落PCR验证阳性克隆。5.根据权利要求4所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(4)中所述Q
‑
PCR标准曲线的构建具体为：将步骤(3)中阳性克隆的PCR产物进行胶回收纯化，测定回收产物中DNA浓度，计算回收产物中DNA的拷贝数；随后对回收产物中DNA进行10倍梯度稀释，分别将稀释产物作为模板进行Q
‑
PCR，构建相应的标准曲线。6.根据权利要求5所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(5)中所述环境样品中新型氯霉素抗性基因的定量检测具体为：将环境样品的基因组DNA作为模板进行Q
‑
PCR，其与步骤(4)中Q
‑
PCR技术的体系和程序相同；根据步骤(4)中构建的Q
‑
PCR标准曲线，对环境样品中新型氯霉素抗性基因的拷贝数进行定量。7.根据权利要求1所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，当新型氯霉素抗性基因的核酸序列为SEQ ID NO：1时，包括以下步骤：(1)环境样品的预处理以及基因组DNA的提取：将采集得到的环境样品经8000rpm，4℃离心10分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置
‑
80℃保存；基因组DNA的提取采用FastDNA
TM Spin Kit(MP Biomedicals,USA)试剂盒，具体步骤参照试剂盒使用说明；(2)目的基因的扩增：根据新型氯霉素抗性基因的核酸序列，采用Primer Pre...

【专利技术属性】
技术研发人员：李炳，梁贺彬，张家禹，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：