一种沙门氏菌的CPA检测引物及检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种沙门氏菌的CPA检测引物及检测试剂盒和检测方法，该针对靶点invA设计的CPA引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌的CPA检测引物及检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种沙门氏菌的CPA检测引物及检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌是一种常见的食物传播性的人畜共患病病原菌，可通过被污染的食品、饲料或粪便感染人和动物，可在人和动物的肠道中寄生生存，临床表现为败血症、胃肠炎及其他组织的局部炎症和食物中毒，对人类和动物生命健康造成很大危害。沙门氏菌的主要传播媒介是通过家禽、蛋、奶、肉类等营养丰富的禽畜产品进行传播，容易污染水源及食品等。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列于榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。在我国每年有3亿人作呕因感染沙门氏菌而患病，占食源性致病菌总致病的70％
‑
80％，严重危害人类身体的健康安全。沙门氏菌鉴定的传统方法主要是根据形态学特征、培养特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌体特征等
[0003]目前微生物的检测鉴定方法主要分为传统培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。培养鉴定法的操作繁琐、实验周期长，而免疫检测法对实验人员专业水平要求高，成本较高。而核酸扩增方法主要分为聚合酶链式反应和恒温扩增技术。交叉引物恒温扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)技术与其他核酸扩增技术相比，可以通过不同的酶和特异性引物在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，设备简单，成本较低，且扩增时间大大缩短，因此在科学检验检疫技术中脱颖而出，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于弥补现有沙门氏菌检测方法的缺点和不足，提供一种沙门氏菌的CPA检测引物。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种沙门氏菌的CPA检测试剂盒。
[0006]本专利技术的再一目的在于提供一种沙门氏菌的CPA检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种沙门氏菌的CPA检测引物，是针对其靶点invA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
[0009]靶点invA剥离引物4s：5
’‑
CTGAGCGATAACAGCATT
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0010]靶点invA剥离引物5a：5
’‑
TGCGTTACCCAGAAATAC
‑3’
(SEQ ID NO.2)；
[0011]靶点invA交叉引物2a1s：5
’‑
TGATGATAGGTCGTTGGATGCGT GGTAAAT TATTCGG
‑3’
(SEQ ID NO.3)；
[0012]靶点invA特异引物2a：5
’‑
TGATGATAGGTCGTTGGAT
‑3’
(SEQ ID NO.4)；
[0013]靶点invA特异引物3a：5
’‑
GCCAAAGGAAGCGACTTC
‑3’
(SEQ ID NO.5)。
[0014]一种沙门氏菌的CPA检测试剂盒，包括上述的沙门氏菌的CPA检测引物。
[0015]所述试剂盒中，各CPA检测引物的浓度优选10μM。
[0016]所述的试剂盒还包括如下组分：
[0017]A、2
×
反应缓冲液：40.0mM的Tris
‑
HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
[0018]B、Bst DNA聚合酶；
[0019]C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；
[0020]组分B中所述的Bst DNA聚合酶优选浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。
[0021]组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
[0022](i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；
[0023](ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL 1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
[0024]一种沙门氏菌的CPA检测方法，包括如下步骤：
[0025](1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD
260
/OD
280
值为1.8～2.0；
[0026](2)分别建立检测invA的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应；
[0027]其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
[0028](3)针对靶点invA的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有沙门氏菌；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有沙门氏菌。
[0029]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0030](1)本专利技术中所提供的针对沙门氏菌特异性靶序列invA所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列invA的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统沙门氏菌检测的周期。
[0031](2)目前，有文献报道采用交叉引物恒温扩增反应技术检测食源性致病菌，但是检测灵敏度不高，相较于普通PCR没有体现交叉引物恒温扩增技术灵敏度方面显著的优越性。而本专利技术确保检测的可靠性、特异性和高灵敏度。这对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。
[0032](3)本专利技术在恒温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌的CPA检测引物，其特征在于：是针对靶点invA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点invA剥离引物4s：5
’‑
CTGAGCGATAACAGCATT
‑3’
(SEQ ID NO.1)；靶点invA剥离引物5a：5
’‑
TGCGTTACCCAGAAATAC
‑3’
(SEQ ID NO.2)；靶点invA交叉引物2a1s：5
’‑
TGATGATAGGTCGTTGGATGCGTGGTAAATTATTCGG
‑3’
(SEQ ID NO.3)；靶点invA特异引物2a：5
’‑
TGATGATAGGTCGTTGGAT
‑3’
(SEQ ID NO.4)；靶点invA特异引物3a：5
’‑
GCCAAAGGAAGCGACTTC
‑3’
(SEQ ID NO.5)。2.一种沙门氏菌的CPA检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的CPA检测引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：各CPA检测引物的浓度为10μM。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括如下组分：A、2
×
反应缓冲液：40.0mM的Tris
‑
HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，体积分数0.2％的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs；B、Bst DNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振波，林欣，骆玉婷，刘君彦，陈玲，叶燕锐，李晓玺，洪玮，彭芳，付欣，户帅锋，苏健裕，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：