用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子标记技术领域，具体涉及鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用。本发明专利技术提供的SNP分子标记，其包含位于如SEQ ID NO.1所示序列第37位多态性为A/C的核苷酸序列，该SNP分子标记的多态性位点为A，对应于布鲁氏菌疫苗株M5，多态性位点为C，对应于野毒株或其他布鲁氏菌疫苗株。本发明专利技术的SNP分子标记及其检测引物和探针可实现布鲁氏菌疫苗株M5和野毒株、其他布鲁氏菌疫苗株的简便和高效鉴别，准确性较高，可应用于布鲁氏菌病病原监测和流行病学分析，为布鲁氏菌病防控提供精准的技术支撑。的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用


[0001]本专利技术涉及分子标记
，具体涉及用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌（Brucella）是一种细胞内寄生的革兰阴性球杆菌，引起布鲁氏菌病（简称布病）。2006年以前布鲁氏菌分为6个种，共19个生物型，包括牛种(Brucella abortus)8个生物型、羊种(Brucella melitensis)3个生物型、猪种(Brucella suis)5个生物型、犬种(Brucella canis)、绵羊附睾种(Brucella ovis)和沙漠森林野鼠种(Brucella neotomae)各1个生物型。目前布鲁氏菌增加了5个新种：Brucella ceti(分离自鲸鱼和海豚)、Brucella pinnipedialis(分离自鳍足类)、Brucella microti(分离自田鼠)、Brucella inopinata(分离自乳房移植病人的血液和伤口分泌液)和 Brucellapapionis（分离自狒狒）。布鲁氏菌各生物型的G+C含量为55％～59％，DNA高度同源，同源性均在90％以上，基因组大小和组成相似。
[0003]免疫家畜既可保护牲畜不受布鲁氏菌感染，也间接地保护了人群。羊种布鲁氏菌5号菌种（M5菌苗）是免疫家畜常用的畜用疫苗。此疫苗用于免疫羊群（绵羊、山羊），免疫方法是皮下注射或气雾免疫，使用方便，保护期1年，效果良好。牛群的免疫常用牛种布鲁氏菌19号菌株活菌苗（皮下注射）和猪种布鲁氏菌2号菌株活菌苗（S2菌苗）的免疫效果均很好。
[0004]布鲁氏菌野毒株和疫苗株的鉴别诊断一直是布鲁氏菌研究的热点。动物流行病学调查和疫情处置中，通过血清学检测来鉴别自然感染和疫苗感染往往不具有特异性，因此从分子生物学角度来寻找特异鉴别位点已迫在眉睫。比较基因组学不仅可以进行全基因组的比较和系统发生的进化关系分析，还可进行细菌基因组多态性的研究，从而揭示基因潜在的功能、阐明物种进化关系及基因组的内在结构。布鲁氏菌的比较基因组学研究不仅加快了新的功能基因和主要致病差异基因的发现，而且为临床实践中疫苗株和野毒株感染鉴别诊断提供了重要技术支撑。随着二代测序技术的发展，常见的疫苗株和亲本菌株的全基因组测序完成，利用比较基因组学分析疫苗株和野毒株在基因组水平的差异，有助于开发疫苗株和野毒株鉴别诊断的新方法。对羊种强毒株M28
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12和羊种疫苗株M5、M111的比较基因组学研究发现M5、M28
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12和M111共有1370个单核苷酸多态性，其中89个来自M5和Mlll以及M28
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12，这些多核苷酸多态性位点可能来自于疫苗株的突变。这些突变位点的发现对设计新的更加安全的疫苗具有重要的启示。
[0005]随着测序技术的发展，细菌基因组测序及全基因组比较提供了一种全新的基于细菌全基因组进行分析进而对种群结构进行分组和聚类的方法。但是该方法缺陷是成本较高，且高度依赖于测序仪，不能应用于缺乏测序仪的基层机构。基于细菌基因组两两比较所得到的SNP仅能代表菌株间差异，是否可能用于鉴定或分型需进行实验评估。然而细菌基因组间比较所得到的SNP少则几百个，多则几万个，如果依次进行评估，则工作量非常巨大，需采用多重细菌基因组比对新技术对SNP位点进行筛选。
[0006]目前，实时荧光定量PCR（RT
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PCR）方法在布鲁氏菌检测、布鲁氏菌菌种鉴别、疫苗株与野毒株区分等方面得到了广泛应用，满足了检验检疫、流行病学调查、人和动物布病诊断等多方面的需求。
[0007]布鲁氏菌疫苗株M5可能造成人感染，且动物接种M5疫苗后产生的抗体很难和自然感染的野毒株产生的抗体进行鉴别诊断，影响了动物布病监测和疫情处置。因此，开发可区分鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的分子标记以及简便、快速、特异、而低成本的RT
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PCR鉴定方法具有重要意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其引物探针组合。本专利技术的另一目的是提供该SNP分子标记及其引物探针组合的应用。
[0009]为实现上述目的，本专利技术首次基于最小核心组分型技术对布鲁氏菌全基因组信息进行系统的分析。具体从NCBI公开数据库下载羊种布鲁氏菌（共136株）公开的Complete和Scaffold基因组，基于Blast方法，将中国疾控中心传染病所布鲁氏菌病控制室保存的M5疫苗株经测序的genome GCA_000348645.1作为参考基因组，与135株羊种布鲁氏菌的基因组依次比对，如相似度大于60%且比对序列超过原序列的70%，则认为该基因存在于该基因组中。按照此分析策略，搜索出在135株羊种布氏菌中存在的Core gene。利用Mummer程序，将Core gene序列与135个基因组依次比对，查找SNP位点，并构建SNP矩阵。
[0010]将5株M5疫苗株（两株来自中国疾控中心传染病所布鲁氏菌病控制室测序的序列，三株来自NCBI数据库）定义为Group 1（疫苗组）；将131株布鲁氏菌野毒株（136株中131株为野毒株）及两株非M5布鲁氏菌疫苗株S2（猪种）和A19（牛种）定义为Group2。基于上一步获得的SNP矩阵，共119756个SNP，筛查可以区分两组菌株的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）位点。可区分两组菌株的SNP位点应具有在该位点组内各菌株间无差异，组间不同的特点。按照以上策略，共筛选出4个SNP位点。进一步在这4个位点中进行筛选（由于另外三个位点所在序列中仍有1
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3个SNP，会干扰疫苗株的鉴定，故只选择了除靶基因中存在唯一SNP，而无任何其他SNP的一个位点位点），最终得到可准确鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记，并设计和筛选用于检测该SNP分子标记的引物和探针。
[0011]具体地，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供用于鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记，其包含位于如SEQ ID NO.1所示序列第37位多态性为A/C的核苷酸序列。
[0012]本专利技术所述的SNP分子标记的多态性位点位于布鲁氏菌MKPBFDOI_01277 hypothetical protein的第37位，多态性为A/C。
[0013]布鲁氏菌不同菌株的MKPBFDOI_01277 基因序列可通过数据库获取，其中，布鲁氏菌疫苗株M5的MKPBFDOI_01277 基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]本专利技术所述的SNP分子标记具体可为序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段。
[0015]以上所述SNP分子标记的多态性位点为A，对应于布鲁氏菌疫苗株M5，多态性位点为C，对应于野毒株或其他疫苗株。
[0016]进一步地，本专利技术提供用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记，其特征在于，其包含位于如SEQ ID NO.1所示序列第37位多态性为A/C的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的多态性位点为A，对应于布鲁氏菌疫苗株M5，多态性位点为C，对应于非布鲁氏菌疫苗株M5。3.用于鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的引物组，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2
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3所示。4.与权利要求3所述的引物组配套使用的探针组，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4
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5所示。5.权利要求3所述的引物组或权利要求4所述的探针组在制备用于鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的试剂盒、或鉴别布鲁氏菌疫苗株M5中的应用。6.鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物组，或者包括权利要求3所述的引物组和权利要求4所述的探针组。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序包括如下步骤：（1）提取待测样品的基因组DNA；（2）以所述基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2
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3所示引物组与SEQ ID NO.4
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5所示探针组进行RT
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【专利技术属性】
技术研发人员：姜海，张雯，朴东日，杨晓雯，田国忠，赵鸿雁，范玉，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：