一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组、LAMP试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及病原检测技术领域，具体公开一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组、LAMP试剂盒及其应用。所述检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组包括一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP，F3的序列如SEQ ID NO:1所示，B3的序列如SEQ ID NO:2所示，FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，BIP的序列如SEQ ID NO:4所示。利用本申请的LAMP引物组，可准确检测出生姜腐烂病病原(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)，特异性强、灵敏度高，对生姜腐烂病病原的最低检测限为10fg/μL，对控制生姜腐烂病病害发生、规避病害流行风险以及提高生姜产量和经济效益具有重要意义。益具有重要意义。益具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组、LAMP试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及病原检测
，尤其涉及一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组、LAMP试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]生姜腐烂病是近年来发现的一种新的生姜病害，造成生姜根茎部腐烂，坏死，具有发病快、传染性强、危害大等特点，进而导致生姜减产甚至绝收，严重影响生姜产量及品质。生姜腐烂病的症状与姜瘟病的类似，但是其病原菌完全不同，生姜腐烂病的病原菌经鉴定为肠杆菌(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)。
[0003]对于该新发病害生姜腐烂病若是继续沿用与姜瘟病类似的防治方法，其治疗效果不佳，因此，在种姜筛选或病害侵染初期及时准确检测生姜腐烂病原，对于控制病害发生、规避病害流行风险以及提高生姜产量和经济效益具有重要意义。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本申请提供一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组、LAMP试剂盒及其应用，能够简单、高效的检测出生姜腐烂病原，特异性好、灵敏度高。
[0005]为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：
[0006]一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组，包括一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP，所述外引物的序列为：
[0007]F3：5'
‑
CAGGCCGTTCCAACTCTG
‑
3'；
[0008]B3：5'
‑
AACGGGTGTATTTGGTCAGG
‑
3'；
[0009]所述内引物的序列为：
[0010]FIP：5'
‑
GTAACACCGGAGTCAACGGCAA
‑
GCTGATAAGCCGCTGGTTG
‑
3'；
[0011]BIP：5'
‑
ACGTGGCGGTACTGTTCAGTAC
‑
TTCGCCGGATACATCTCGC
‑
3'。
[0012]相对于现有技术，本专利技术提供的检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组具有以下优势：
[0013]本申请以肠杆菌特异性引物ropB序列为基础，特异性设计一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP，使得含有生姜腐烂病病原DNA片段的待测物能够利用上述引物进行大量扩增，进而准确检测出生姜腐烂病病原(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌)，且与姜瘟病原青枯雷尔氏菌，白菜软腐病原欧文菌、芽孢杆菌、水稻白叶枯病原黄单胞杆菌、马铃薯黑胫病原黑腐果胶杆菌、黄瓜角斑病原丁香假单胞菌、大肠杆菌、生姜花皮病原链格孢、生姜花皮病原尖孢镰刀菌和麦根腐平脐孺孢菌等均无交叉扩增反应，特异性强；且上述LAMP引物组的灵敏度高，对生姜腐烂病病原的最低检测限为10fg/μL，能够在种姜筛选或病害侵染初期及时准确检测出生姜腐烂病原，同时，检测的准确度高，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在任意场合进行快速检测生姜腐烂病病原的目的，对控制生姜腐烂
病病害发生、规避病害流行风险以及提高生姜产量和经济效益具有重要意义。
[0014]本专利技术还提供上述检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组在非诊断性检测生姜腐烂病病原肠杆菌中的应用。
[0015]优选的，所述肠杆菌为阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌或弗氏柠檬酸杆菌中的至少一种。
[0016]本专利技术还提供一种检测生姜腐烂病病原的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含上述检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组。
[0017]优选的，所述试剂盒还包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、DNA聚合酶和去离子水。
[0018]本专利技术还提供利用上述试剂盒检测生姜腐烂病病原的方法，具体操作为：提取待测物的基因组DNA为模板，用上述LAMP试剂盒进行环介导等温扩增，扩增完成后加入荧光染料，观察结果。
[0019]环介导等温扩增结束后，向扩增产物中加入荧光染料后观察颜色变化，若是颜色发生变化，说明待测物中含有生姜腐烂病病原肠杆菌DNA片段；若是颜色不发生变化，还呈现荧光染料本身的颜色，说明待测物中不含有生姜腐烂病病原肠杆菌DNA片段，或是含有其他其他病原菌，并未发生扩增反应。
[0020]上述提取待测物的基因组DNA的方法为本领域常规的DNA提取方法。
[0021]上述检测生姜腐烂病病原的方法，操作简单、反应时间短、反应结果直观准确，可用于生姜腐烂病病原的快速检测。
[0022]优选的，所述环介导等温扩增的反应体系包括以下试剂及用量：10
×
Thermopol缓冲液2.5μL，100mM硫酸镁1.5μL，10mM dNTP 3.5μL，5μMF3、5μM B3、40μM FIP和40μM BIP各1μL，8000U/mL BstDNA聚合酶1μL，DNA模板1μL～2μL，去离子水补足至25μL。
[0023]上述dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸混合物)中每种碱基的终浓度为1.4mM。
[0024]上述环介导等温扩增的反应体系中DNA模板中的浓度为＞10个拷贝数。
[0025]上述优选的反应条件可进一步提生姜腐烂病病原的检测效率。
[0026]优选的，所述环介导等温扩增的反应温度为60℃，反应时间为60min。
[0027]优选的，所述荧光染料为SYBR Green I核酸染料，且所述荧光染料的用量为0.5μL。
[0028]环介导等温扩增结束后，向扩增产物中加入0.5μL的SYBR Green I核酸染料后观察颜色变化，若是颜色呈荧光绿色，说明待测物中含有生姜腐烂病病原肠杆菌DNA片段；若是颜色不发生变化，还呈现荧光染料本身的颜色橙色，说明待测物中不含有生姜腐烂病病原肠杆菌DNA片段，或是含有其他其他病原菌，并未发生扩增反应。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1是本专利技术实施例1提供的检测生姜腐烂病病原方法特异性试验结果图；
[0031]图2是本专利技术实施例2提供的检测生姜腐烂病病原方法灵敏度试验结果图。
具体实施方式
[0032]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0033]以下实施例中使用的主要试剂及仪器：BstDNA聚合酶(NEB公司)、缓冲液(NEB公司)、硫酸镁(NEB公司)、dNTP(NEB公司)、SYBR Gree n I核酸染料(酷来搏公司)，去离子水(康为试剂公司)、真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(聚合美公司)、PCR仪(BIO
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组，其特征在于：包括一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP，所述外引物的序列为：F3：5'
‑
CAGGCCGTTCCAACTCTG
‑
3'；B3：5'
‑
AACGGGTGTATTTGGTCAGG
‑
3'；所述内引物的序列为：FIP：5'
‑
GTAACACCGGAGTCAACGGCAA
‑
GCTGATAAGCCGCTGGTTG
‑
3'；BIP：5'
‑
ACGTGGCGGTACTGTTCAGTAC
‑
TTCGCCGGATACATCTCGC
‑
3'。2.如权利要求1所述的检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组在非诊断性检测生姜腐烂病病原肠杆菌中的应用。3.如权利要求2所述的检测生姜腐烂病病原的LAMP引物组在非诊断性检测生姜腐烂病病原肠杆菌中的应用，其特征在于：所述肠杆菌为阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌或弗氏柠檬酸杆菌中的至少一种。4.一种检测生姜腐烂病病原的LAMP试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫红飞，张文朝，赵娜，李令蕊，房小力，郝晓宇，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：