快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物及方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物及方法。快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1~6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。通过引物浓度配比实验确定三重LAMP反应体系引物浓度，进而建立三重LAMP检测方法。本发明专利技术提供的LAMP引物可以实现金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速检测及高度特异性检测。本发明专利技术建立的三重LAMP检测方法可以有效解决单重LAMP反应检测通量低和假阳性的问题。检测通量低和假阳性的问题。检测通量低和假阳性的问题。

【技术实现步骤摘要】
快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测
，特别是涉及快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物及方法。

技术介绍

[0002]目前，病原微生物检测领域应用比较广泛的检测方法主要有生化法、免疫学方法、分子生物学技术、代谢学技术等。其中分子生物学技术中的环介导等温扩增技术(LAMP)具有操作简单、无需大型仪器设备、成本低廉、反应时间短、结果判定简单、比常规分子生物学方法具有更高的灵敏度和特异性等优点而受到广泛关注。LAMP仅需普通水浴锅就能快速、高效、简便地对病原微生物进行鉴定，因而具有推广性，可以作为常规的检测工具。对设施简陋、经济状况较差、无法使用昂贵的大型检测仪器的偏远地区或乡村来说，建立一种快速、准确、灵敏、操作简便的病原微生物检测技术十分关键。
[0003]LAMP是一种利用具有链置换特性的DNA聚合酶对识别的核酸序列进行催化扩增的新型技术。该技术的核心要点是能特异性识别目的基因保守片段的4条或6条引物以及具有链置换特性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)。除此之外反应体系还包括dNTPs、模板DNA、Mg
2+
、甜菜碱等。LAMP反应是一种等温条件下的核酸扩增反应，通过在60℃左右保持几十分钟，即可完成反应，阳性结果中，LAMP体系的DNA扩增链式循环产生大量目的基因片段，产生反应副产物焦磷酸镁白色沉淀，可根据浊度结果判定反应结果。
[0004]LAMP技术也有一些缺陷限制了其应用于实际场景中，例如假阳性结果和检测通量。单重LAMP只能检测单一基因片段，其效率已不足以满足当前的众多需求，且多种病原菌的单重LAMP检测步骤具有大量的重复性，逐个单一检测耗时耗力；LAMP方法是基于DNA扩增的一种技术手段，死菌的DNA也可能被扩增，因此LAMP假阳性结果的来源可能是目标死菌。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，克服常规技术普遍存在的操作复杂，价格昂贵，需要大型仪器，耗时长。
[0006]本专利技术的技术方案快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。
[0007]本专利技术还提供了快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的方法，包括如下步骤：
[0008]步骤1、采用叠氮溴乙锭对样本进行前处理，用磁珠法提取DNA；
[0009]步骤2、向步骤1提取好的DNA样本中加入LAMP反应体系，所述LAMP反应体系为单重反应体系或三重反应体系，所述单重反应体系包括1套nuc引物、1套invA引物或1套ipaH引物，10
×
LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；所述三重反应体系包括1套nuc引物、1套invA引物和1套ipaH引物，10
×
LAMP buffer，
dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；1套nuc引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～6所示，1套invA引物核苷酸序列如SEQ ID No.19～24所示；1套ipaH引物核苷酸序列如SEQ ID No.37～42所示；
[0010]步骤3、将步骤2所得产物进行通过浊度仪进行检测。
[0011]其中，步骤2中，单重反应体系的反应温度为65℃。
[0012]具体的，步骤2中，单重反应体系中dNTPs浓度为0.6～1.4mmol/L。
[0013]优选的，步骤2中，单重反应体系中dNTPs浓度为1.0mmol/L。
[0014]具体的，步骤2中，单重反应体系中的10
×
LAMP buffer中Mg
2+
浓度为2～10mmol/L。
[0015]优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套nuc引物时，Mg
2+
浓度为4～6mmol/L。
[0016]优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套invA引物时，Mg
2+
浓度为4～8mmol/L。
[0017]优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套ipaH引物时，Mg
2+
浓度为4mmol/L。
[0018]其中，步骤2中，三重反应体系的反应温度为60℃。
[0019]其中，步骤2中，三重反应体系中3套引物总浓度为1～3μmol/L。
[0020]优选的，步骤2中，三重反应体系中3套引物总浓度为1.5μmol/L。
[0021]具体的，步骤2中，三重反应体系中dNTPs浓度0.6～1.4mmol/L。
[0022]优选的，步骤2中，三重反应体系中dNTPs浓度1.0mmol/L。
[0023]具体的，步骤2中，三重反应体系中的10
×
LAMP buffer中Mg
2+
浓度2～10mmol/L。
[0024]优选的，步骤2中，三重反应体系中的10
×
LAMP buffer中Mg
2+
浓度4mmol/L。
[0025]dNTPs浓度优选主要从反应开始扩增的时间、反应过程中的扩增效率、反应结束后的扩增量三个方面考虑；浓度为1.0mmol/L时较早开始扩增，且反应过程中保持较高的扩增效率，反应结束后扩增量较高，所以选取1.0mmol/L为最优浓度。Mg
2+
浓度优选主要从反应开始扩增的时间、反应过程中的扩增效率、反应结束后的扩增量三个方面考虑。
[0026]本专利技术建立的三重LAMP检测方法可以同时特异性检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种病原微生物，检测通量是单重LAMP的3倍，有效解决了单重LAMP检测通量低的缺陷；且针对死菌造成的假阳性结果，本专利技术通过采用EMA(叠氮溴乙锭)对样本进行前处理可以有效避免死菌对反应结果的影响，解决了单重LAMP假阳性的缺陷。
[0027]本专利技术前处理时用磁珠法提取DNA，在LAMP检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种病原微生物的相关研究中多用试剂盒法、热裂解法、碱法以及改良后的碱法、CTAB法、改良型SDS法等。
[0028]检测指标：浊度仪中浊度曲线随扩增反应进行是否上升，浊度曲线上升即为阳性反应，反应结束后浊度越高代表扩增效率越高。
[0029]本专利技术设计的单重LAMP引物及建立的三重LAMP检测方法在病原微生物检测领域的应用也属于本专利技术的保护范围。优选的，所述应用的方法是将需要检测的样品分别加入单重LAMP反应体系或三重LAMP反应体系，在65℃(单重)或60℃(三重)恒温下进行。
[0030]本专利技术的有益效果在于：
[0031](1)本专利技术设计的单本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1~6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。2.快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、采用叠氮溴乙锭对样本进行前处理，用磁珠法提取DNA；步骤2、向步骤1提取好的DNA样本中加入LAMP反应体系，所述LAMP反应体系为单重反应体系或三重反应体系，所述单重反应体系包括1套nuc 引物、1套 invA引物或1套ipaH 引物，10
×
LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶， DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；所述三重反应体系包括1套nuc 引物、1套 invA引物和1套ipaH 引物，10
×
LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；1套nuc 引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1~6所示，1套 invA引物核苷酸序列如SEQ ID No. 19～24所示；1套ipaH 引物核苷酸序列如SEQ ID No. 37～42所示；步骤3、将步骤2所得产物进行通过浊度仪进行检测。3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，单重反应体系的反应温度为65℃。4.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，单重反应体系中dNTPs 浓度为0.6～1.4mmol/L；优选的，步骤2中，单...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐璇，赵旭欢，吕秀龙，张影，何倩，付诗琪，吉芳英，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：