适用于高通量筛选的新的双特异性形式制造技术

本公开涉及新型双特异性蛋白质复合物和使用所述复合物筛选协同或新型生物功能的方法。双特异性形式特别适合于高通量筛选，因为其所有组分可以作为个体单元从细胞表达，并且所述单元可以简单地通过混合进行组装而无需使用缀合或偶联化学。使用缀合或偶联化学。使用缀合或偶联化学。

【技术实现步骤摘要】
适用于高通量筛选的新的双特异性形式
[0001]本申请是CN 201580028405.9的分案申请。
专利

[0002]本公开涉及检测异二聚体系链束缚的双特异性蛋白质复合物中的协同生物功能的方法，特别是体外/离体方法(双特异性蛋白质复合物的文库/多元体)，及其试剂盒和组合物。本公开还涉及所述新型双特异性蛋白质复合物及其在治疗、研究和实验目的(特别是在寻找协同生物功能的测定中)中的用途。本公开还延伸至制备所述双特异性复合物的方法。
[0003]专利技术背景
[0004]体内生物学机制是极复杂的信号级联，其难以去卷积(deconvolute)和理解。此类信号传导的一个实例是激活T细胞所需的信号传导，参见图1，来自www.cellsignal.com。T细胞的活化需要至少两个信号。
[0005]T细胞受体对抗原的识别被认为是第一信号，并且第二信号由共刺激产生，所述共刺激由T细胞上的其它表面分子与抗原呈递细胞上的其它分子的连接产生。
[0006]因此，T细胞活化可用于举例说明生物功能的调节可能需要多个信号。其他生物过程同样复杂或更复杂。尽管基于细胞的体外筛选具有并且能够帮助获得对体内机制的洞察，但仍然存在如何鉴定调节生物功能的适当配体对的问题。
[0007]双特异性抗体被广泛预期在下一代生物治疗剂中起主要作用(D.Holmes,Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10；798)。它们具有在更大比例的患者中提供优异的，长期的，广泛的功效的潜力。这可以通过在共同疾病途径中同时共同接合不同的抗原，从而减少冗余来实现；或通过靶向来自独立途径的抗原以提供累加或协同效应来实现。
[0008]双特异性抗体有助于获得新型生物学，诸如：
[0009]1)细胞上的交联受体，
[0010]2)诱导细胞介导的效应，
[0011]3)将细胞因子定位于细胞以调节信号传导或局部阻断细胞因子功能，
[0012]4)同时接合多个表位以产生“新活性”，增加功能或特异性，其可能不会由单一单克隆抗体或实际上未连接的抗体(“聚
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单克隆”)的混合物表现。
[0013]目前接合双重靶标的策略主要基于已知机制的合理设计，包括：交联抑制性受体、受体的共同接合/聚集(clustering)、阻断多个刺激途径、抑制性受体的选择性接合和阻断不同途径诸如共刺激和细胞因子信号传导。然而，与已知机制和靶标相关的现有技术水平是在该领域取得进展的限制因素。
[0014]虽然双特异性抗体作为生物治疗剂具有巨大的潜力，但是与单克隆抗体相比，它们在发现和开发过程中也提出了一组增加的挑战。两个关键的困难领域是，1)成功的双特异性抗体形式的开发，和2)选择双特异性抗体将与其交联或共同接合的靶标对。
[0015]现在已经开发了许多有希望的双特异性抗体形式，其可潜在地用作成功的治疗剂，包括DVD
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Ig(Abbvie)、DuoBodies(Genmab)、Knobs
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in
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Holes(Genentech)、共同轻链
(Merus)。然而，在这些情况的每一种情况下，这些形式不理想地适合于高通量靶标
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双重
‑
抗原发现筛选，以使得能够发现用于与双特异性抗体交联的新抗原对。
[0016]通常，对于单个双特异性抗体构建体，需要从发现载体的原始来源(例如噬菌体展示、杂交瘤或单个B细胞克隆)亚克隆至少两个可变区至合适的双特异性表达载体中，双特异性的每个臂必须被表达，并纯化所得的双特异性抗体。如果要组合大量的可变区对以尝试筛选所发现的可变区的最有效组合或发现新的抗原对，则该克隆和随后的表达努力很快变成明显的实际瓶颈。
[0017]例如，如果针对50个细胞表面靶标的小组发现50个独特抗体，则可潜在地产生总共2500个双特异性抗体(设想为X
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乘
‑
Y网格)。使用上述双特异性抗体形式，这将需要至少100个个体克隆反应(50
‑
X和50
‑
Y)，然后是2500个抗体表达实验。将起始单克隆抗体的数目增加至100将使克隆反应的最小数目增加至200(100
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X和100
‑
Y)，并将表达数目增加至10,000。
[0018]通常，该“表达瓶颈”的根本原因是以下事实，即上述形式需要最终双特异性构建体的两个蛋白质链“一半”在同一细胞中的单个表达实验内同时表达。因此，对于许多形式，为了产生2500个双特异性抗体，需要2500个表达实验。
[0019]如果双特异性抗体形式是单顺反子(即克隆并表达为单链蛋白)，例如单链双抗体，则“表达瓶颈”进一步恶化，因为克隆实验的数目对于上述给出的数目将分别为2500和10,000。
[0020]此外，在表达后，可能需要充分纯化以分离期望的构建体。
[0021]一些双特异性方法在双特异性构建体中使用共同的轻链以减少克隆的量，尽管这不减少表达实验的数目。此外，使用共同的链诸如共同的轻链，使得抗体发现的挑战更加困难，因为更加难以找到起始抗体的可变结构域，因为抗体需要单独通过一条链(诸如重链)以足够高的亲和力结合其抗原。
[0022]因此，在大规模和高通量筛选中使用目前的双特异性形式来鉴定新的抗原对是不切实际的，并已经导致继续使用仅由假设驱动的方法来进行双特异性抗原靶向。
[0023]我们建议，与其设计并测试有限选择的双特异性抗体(其接合两个已知靶标上的给定表位)，不如说开发利用双特异性抗体获得新型生物学的真正潜力只能通过利用双特异性抗体或蛋白质配体的在的多样性组合小组进行广泛的功能筛选工作来实现。为了便于该筛选，需要能够产生大量不同的双特异性蛋白质的形式和方法，可容易地构建所述双特异性蛋白质并在多种功能筛选中筛选其功能效应。该方法允许协同对的偶然鉴定。
[0024]因此，产生和筛选作为各种抗原特异性的组合存在的大量双特异性蛋白质复合物是有用的。特别地，能够以快速和高效的方式产生和筛选大量不同的双特异性抗体复合物将是有用的。存在一系列已如上所述的用于制造双特异性抗体的现有方法。然而，这些方法中的每一种都具有其不利方面，下面进一步详细描述的替代方法亦如此。
[0025]如何有效鉴定双特异性和多特异性构建体的靶标的问题在本领域中还没有得到充分解决。例如WO2014/001326采用蛋白质与DNA片段的化学缀合，其中所述DNA片段与互补DNA序列杂交，所述互补DNA序列将两个这样的蛋白质连接在一起，以产生包含至少两个靶向实体的定制的患者特异性多特异性分子。如果要将其应用于鉴定新的双特异性组合，则存在与该方法相关的许多困难，例如蛋白质与DNA的缀合可导致对该蛋白质的活性和/或结
构的损害。特别地，蛋白质
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DNA杂交物不是天然存在的，因此存在干扰的可能性。另外，连接蛋白质和DNA所需的化学缀合增加了该方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有式A
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X:Y
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B的双特异性蛋白质复合物，其中：A
‑
X是第一融合蛋白；Y
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B是第二融合蛋白；X:Y是异二聚体系链；:是X与Y之间的结合相互作用；A是选自Fab或Fab'片段的所述双特异性蛋白质复合物的第一蛋白质组分；B是选自Fab或Fab'片段的所述双特异性蛋白质复合物的第二蛋白质组分；X是独立地选自抗原或抗体或其结合片段的结合对的第一结合伴侣；和Y是独立地选自抗原或抗体或其结合片段的结合对的第二结合伴侣；条件是当X是抗原时，Y是对由X表示的抗原具有特异性的抗体或其结合片段，并且当Y是抗原时，X是对由Y表示的抗原具有特异性的抗体或其结合片段。2.权利要求1的双特异性蛋白质复合物，其中A是Fab片段。3.权利要求1或2的双特异性蛋白质复合物，其中B是Fab片段。4.权利要求1至3的任一项的双特异性蛋白质复合物，其中X任选通过接头与Fab或Fab'片段中...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：UCB生物制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：