高效分离纯化重组人凝血因子VIIIFc融合蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效分离纯化重组人凝血VIII因子Fc融合蛋白的方法。所述方法包括亲和层析以及阴离子交换层析步骤；并且所述亲和层析捕获样品在pH 4.0至8.0条件下，采用含5-20％多元醇类有机溶剂的盐离子缓冲液进行洗脱，蛋白样品经一步ProteinA亲和层析分离即可提纯至85％以上；所述纯化方法操作简便，每步层析之间自然衔接，回收率高、成本低且容易放大生产。大生产。

【技术实现步骤摘要】
高效分离纯化重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及Fc融合蛋白纯化领域；更具体地，涉及一种高效分离纯化重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的方法。

技术介绍

[0002]凝血因子VIII(FVIII)是多结构的大分子糖蛋白，分为6个结构域：三个A结构域(A1、A2、A3)，一个富碳水化合物且非必需的中央结构域(B-结构域)和两个C结构域(C1、C2)。成熟的蛋白质由大约分子量为280kDa的轻链和重链组成。轻链分子量约为80kDa，结构包括A3，C1和C2，连接方式为A3-C1-C2。重链分子量约90至200kDa，结构包括A1，A2和B，连接方式为A1-A2-B。重链和轻链连接是金属离子依赖性的。在血浆中，重链和轻链的二聚体再以高亲和力结合冯.维勒布兰德因子(von Willebrand,vWF)，保护其免于成熟前降解。
[0003]目前，凝血因子VIII的纯化工艺普遍存在工艺复杂、成本高、纯度低的问题(Stefan Winge等,Protein Expression and Purification,2015,115:165-175)。亲和层析过程有效去除杂质是下游蛋白制备中的关键因素，然而目前FVIII亲和层析纯化步骤多存在回收率低和成本较高的问题，亲和层析在洗脱步骤中使用大量昂贵试剂，如乙二醇、丙二醇、精氨酸等，这使得填料的使用寿命缩短，有机溶剂残留较多，回收率降低，且大大增加了纯化成本。虽然GE公司开发出新型纯化填料VIII select(Justin T.McCue等,Journal of chromatography A,2009,1216:7824-7830)，但仍存在填料成本较高、回收率低以及洗脱液中使用的试剂昂贵等问题。目前已申报IND或已上市的长效人凝血VIII因子的药物生产厂家，例如，辅仁、Biogen等开发的重组人凝血因子VIII长效产品的纯化工艺依旧存在操作繁琐、成本高及回收率低等问题。
[0004]全球现有大量罹患血友病A患者，还有许多未被诊断或登记，市场需求远远大于产能，而重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的高价格使得药物无法普及应用，而生产成本又是重组蛋白药物价格一直居高不下的主要因素。因此，本领域亟待开发一种高效便捷、成本低廉且适于工业应用的纯化重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的新方法。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的目的在于建立一种操作简便、回收率高、生产成本低的纯化重组人凝血因子VIIIFc融合蛋白方法。
[0006]本专利技术提供一种分离或纯化重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白(简称融合蛋白)的方法，该方法包括以下步骤：
[0007](1)亲和层析：用蛋白A亲和介质捕获融合蛋白，再以洗脱缓冲液洗脱融合蛋白，收集分离产物；
[0008](2)阴离子交换层析：将上述分离产物加载于季铵盐类强阴离子交换层析介质上以分离结构变异体、聚体、去除HCP、DNA等污染物，以洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集分离产物；
[0009]其中，所述融合蛋白是由天然人FVIII或B结构域缺失的/截短的人FVIII及其变体通过肽接头与来源于人的任何抗体同种型的恒定区序列(Fc结构域)或其变体融合而成；所述Fc结构域选自例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区或其变体；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其变体；本专利技术的一优选实施例中，所述重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0010]优选地，亲和层析步骤在选自下列的亲和介质上进行：MabSelect、MabSelect SuRe、Protein A Diamond和MabSelect SuRe LX；优选地使用MabSelect SuRe LX；
[0011]优选地，亲和层析中融合蛋白洗脱前先使用不含或含有较低浓度的有机溶剂的去污缓冲液淋洗以去除部分污染物；所述去污缓冲液包含20mM His-HCl、0.4-1.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02-0.05％Tween-80、0-10％乙二醇，pH为5.0-7.0；优选为20mM His-HCl、1.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80、3-7％乙二醇，pH为5.0-7.0。
[0012]其中，亲和层析中使用的洗脱缓冲液包含浓度为0.2M至1.5M的一种或多于一种的盐、一种或多于一种的多元醇类有机溶剂和一种或多于一种的表面活性剂；和所述洗脱缓冲液还含有浓度为5mM至20mM的钙离子；和所述洗脱缓冲液还含有10mM至50mM的His-HCL缓冲剂；和所述洗脱缓冲液的pH为4.0至8.0，优选为5.0至6.0，更优选为5.0；
[0013]优选地，其中所述盐的实例包括氯化钠、氯化铵、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵等；本专利技术优选的盐是氯化物；本专利技术中最优选的盐是氯化钠；
[0014]优选地，其中所述多元醇类有机溶剂包括但不限于乙二醇、1,2-丙二醇和丙三醇，优选为乙二醇；并且所述有机溶剂的比例为5-40％(w/w)，优选为5-20％；
[0015]优选地，其中所述钙离子选自可溶性钙盐，包括但不限于氯化钙、乙酸钙、乳酸钙、苯甲酸钙；优选为氯化钙；
[0016]优选地，其中所述表面活性剂为吐温-80(Tween-80)或曲拉通X-100(Triton X-100)，浓度为0.01％至0.1％(v/v)，优选为0.02％至0.05％(v/v)。
[0017]优选地，所述洗脱缓冲液包含20mM His-HCl、0.5-2.0M NaCl、5-20mM CaCl2、0.02-0.1％Tween-80、2-20％乙二醇，和所述洗脱缓冲液的pH为4.5至7.0；
[0018]本专利技术的一优选实施例中，所述亲和层析具体包括下列步骤：
[0019](1)用平衡缓冲液(20mM His-HCl、0.2M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80、pH为6.8-7.2)平衡层析柱3-5个柱体积；
[0020](2)上样，载量不高于50000IU/ml；
[0021](3)完成上样后，用上述平衡缓冲液再平衡3-5个柱体积，冲洗未结合的组分；
[0022](4)使用去污缓冲液(20mM His-HCl、0.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80，pH为7.0)淋洗层析柱3-5个柱体积，以去除部分污染物；
[0023](5)最后用洗脱缓冲液(20mM His-HCl、1.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80、15％乙二醇，pH为5.0)洗脱融合蛋白，收集目标峰。
[0024]优选地，阴离子交换层析步骤在选自下列的强阴离子交换介质上进行：Q HP、Toyopearl GigaCap Q-650、DEAE Beads 6FF、Gen本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离或纯化重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)亲和层析：用蛋白A亲和介质捕获融合蛋白，再以洗脱缓冲液洗脱融合蛋白，收集分离产物；(2)阴离子交换层析：将上述步骤分离产物加载于季铵盐类强阴离子交换层析介质上，以洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集分离产物；其中，所述融合蛋白是由天然人FVIII或B结构域缺失的/截短的人FVIII及其变体通过肽接头与来源于人的任何抗体同种型的恒定区序列(Fc结构域)或其变体融合而成；所述Fc结构域选自例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区或其变体；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其变体；本发明的一优选实施例中，所述重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其中，亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液包含浓度为0.2M至1.5M的一种或多于一种的盐、一种或多于一种的多元醇类有机溶剂和一种或多于一种的表面活性剂；和所述洗脱缓冲液还含有浓度为5mM至20mM的钙离子；和所述洗脱缓冲液还含有10mM至50mM的His-HCL缓冲剂；和所述洗脱缓冲液的pH为4.0至8.0，优选为5.0至6.0，更优选为5.0。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤在选自下列的亲和介质上进行：MabSelect、MabSelect SuRe、Protein A Diamond和MabSelect SuRe LX；优选地使用MabSelect SuRe LX。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析步骤在选自下列的强阴离子交换介质上进行：Q HP、Toyopearl GigaCap Q-650、DEAE Beads 6FF、Generik MC-Q、Fractogel EMD TMAE、Q Ceramic HyperD F，优选地使用Q HP。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤，在融合蛋白洗脱前先使用不含或含有较低浓度的有机溶剂的去污缓冲液淋洗以去除部分污染物；所述去污缓冲液包含20mM His-HCl、0.4-1.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02-0.05％Tween-80、0-10％乙二醇，pH为5.0-7.0；优选为20mM His-HCl、1.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80、3-7％乙二醇，pH为5.0-7.0。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的盐包括氯化钠、氯化铵、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵等；优选为氯化物；最优选为盐是氯化钠。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的多元醇类有机溶剂包括乙二醇、1,2-丙二醇和丙三醇，优选为乙二醇；并且所述有机溶剂的比例为5-40％(w/w)，优选为5-20％。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的钙离子选自可溶性钙盐，包括氯化钙、乙酸钙、乳酸钙、苯甲酸钙；优选为氯化钙。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的表面活性剂为吐温-80(Tween-80)或曲拉通X-100(Triton X-100)，并且所述表面活性剂的浓度为0.01％至0.1％(v/v)，优选为0.02％至0.05％(v/v)。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液包含20mM His-HCl、0.5-2.0M NaCl、5-20mM CaCl2、0.02-0.1％(v/v)Tween-80、2-20％(w/w)乙二醇，和所述洗脱缓冲液的pH为4.5至7.0。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析具体包括下列步骤：(1)用平衡缓冲液(20mM His-HCl、0.2M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80、pH为6.8-7.2)平衡层析柱3-5个柱体积；(2)上样，载量不高于50000IU/ml；(3)完成上样后，用上述平衡缓冲液再平衡3-5个柱体积，冲洗未结合的组分；(4)使用去污缓冲液(20mM His-HCl、0.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80，pH为7.0)淋洗层析柱3-5个柱体积，以去除部分污染物；(5)最后用洗脱缓冲液(20mM His-HCl、1.5M NaCl、10mM CaCl2、0.02％Tween-80、15％乙二醇，pH为5.0)洗脱融合蛋白，收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾世香，徐时东，俞灵菊，周波，吴洪，袁永龙，李强，
申请(专利权)人：安源医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：