基因修饰非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种体内包含B2M和FcRn的嵌合基因的免疫缺陷非人动物的构建方法，利用基因编辑的方式将编码非人动物B2M蛋白的核苷酸序列导入免疫缺陷非人动物FcRn基因座，从而构建出包含B2M和FcRn的嵌合基因的非人动物，该动物体内能正常表达包含B2M和FcRn的蛋白复合物，可以作为FcRn信号机理研究、免疫系统研究、免疫相关新药研发具有重要的应用价值。免疫相关新药研发具有重要的应用价值。免疫相关新药研发具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
基因修饰非人动物的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种基因修饰的免疫缺陷非人动物，其表达一种B2M和FcRn蛋白复合物动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]β微球蛋白(beta
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microglobulin)，又称B2M蛋白，是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，存在于除血红细胞外所有的有核细胞中，是FcRn维持人体血清中免疫球蛋白IgG稳态水平必不可少的组成部分。FcRn是由α链和β链(B2M)组成异源二聚体，其在酸性条件下(pH<6.5)会与IgG的Fc区结合，在中性或碱性条件(pH≥7.0)下与IgG解离，这种依赖于pH的结合特性使FcRn能够与酸性内小体内嵌的IgG结合，并将其运回细胞表面，在生理pH条件下释放到细胞表面。这种FcRn介导的循环途径有助于延长IgG的半衰期，并维持其在循环中的稳态。FcRn的α链必须和B2M蛋白装配后才能发挥对于IgG的转运功能。
[0003]除了参与FcRn对于IgG的胞转功能外，B2M还是MHCⅠ类分子中的重要一员，通过与MHC I类分子的α链非共价结合，附着于保守的免疫球蛋白样区域。B2M虽然不直接参与MHC I类分子在免疫应答、免疫调节等过程中的抗原呈递，但它能促进内质网中新合成的MHC I类分子向细胞表面运输，并对MHC I类分子的结构稳定和在细胞表面的表达具有不可或缺的作用。研究表明，B2M缺失的情况下，在细胞表面几乎检测不到MHC I类分子的表达。因此，可以通过敲除B2M基因达到敲除MHC I类分子的目的。
[0004]实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。例如可以通过在免疫缺陷小鼠体内注射人外周血单核细胞(hPBMC)重建人的免疫系统，用于免疫系统发育研究、疫苗或肿瘤药物筛选等多项用途。但由于hPBMC的T细胞受体会非特异性识别小鼠的MHC，导致人T细胞(尤其是CD8+T细胞)在小鼠体内大量增殖，分泌大量的细胞因子，最终引起移植物抗宿主反应(GvHD)，5
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6周内小鼠体重下降并死亡，留给研发人员的实验窗口期非常有限。而且，如果在这种免疫重建的小鼠体内接入肿瘤，由于大量活化T细胞和细胞因子的存在，将使肿瘤免疫药效试验的结果非常复杂，稳定性很差，虽然可以做一些定性试验，但很难精确比较不同抗体的药效和安全性。
[0005]为了克服上述现有实验动物模型存在的不足，兼顾B2M蛋白在免疫球蛋白胞转作用中的功能和避免异种移植物引起的GvHD，解决临床转化方面的需求，本专利技术旨在提供一种B2M基因敲除，但表达嵌合在FcRn基因中的B2M蛋白的免疫缺陷小鼠模型，为肿瘤、移植排斥、病原感染等发病机理、预防及防治药物筛选等提供稳定、高效的临床前实验动物模型。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种FcRn蛋白复合物，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M蛋白和FcRn蛋白。
[0007]其中，所述的B2M蛋白可以为B2M蛋白的全部或可以发挥B2M蛋白功能的某一部分或某几部分的组合。
[0008]其中，所述的FcRn蛋白可以为FcRn蛋白的全部或可以发挥FcRn蛋白功能的某一部分或某几部分的组合。
[0009]优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的信号肽、胞质区、跨膜区和/或胞外区。
[0010]进一步优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的胞质区、跨膜区和/或胞外区。
[0011]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的信号肽、胞质区、跨膜区和胞外区，以及B2M蛋白。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的胞质区、跨膜区和胞外区，以及B2M蛋白。
[0013]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为FcRn蛋白的信号肽、B2M蛋白、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不包含B2M蛋白信号肽。
[0014]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为B2M蛋白、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不包含B2M蛋白信号肽。
[0015]优选的，B2M蛋白和FcRn蛋白的氨基酸序列之间直接或间接连接。更优选为间接连接。进一步优选采用柔性linker连接。更进一步优选柔性linker连接B2M蛋白与FcRn蛋白的胞外区。
[0016]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为FcRn蛋白的信号肽、B2M蛋白、柔性linker、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不含B2M蛋白信号肽。
[0017]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为B2M蛋白、柔性linker、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不含B2M蛋白信号肽。
[0018]优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号至3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号至3号外显子中的任一个、两个或三个外显子编码的氨基酸序列。更进一步优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、70、100、110、118bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含7bp的核苷酸序列；1号外显子的部分不含编码信号肽的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、29bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含11bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
[0019]优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn基因的2号至7号外显子编码的氨基酸序列。
[0020]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分编码的氨基酸序列，以及FcRn基因的2号至7号外显子编码的氨基酸序列。
[0021]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为FcRn基因2号外显子编码的信号肽序列、B2M基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M蛋白和FcRn蛋白。2.根据权利要求1所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的胞质区、跨膜区和/或胞外区，以及B2M蛋白，优选还包含FcRn蛋白的信号肽，优选不含B2M信号肽。3.根据权利要求1
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2任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，B2M蛋白和FcRn蛋白的氨基酸序列之间直接或间接连接；优选为间接连接，进一步优选采用柔性linker连接，更进一步优选柔性linker连接B2M蛋白与FcRn蛋白的胞外区。4.根据权利要求1
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3任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白分别独立来源于人或非人动物，优选的，所述非人动物为啮齿类动物，优选为小鼠或大鼠。5.根据权利要求1
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4任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的FcRn蛋白复合物表达在非人动物中，优选的，所述的非人动物体内MHC I类分子不表达、功能下降或功能缺失；优选的，所述的非人动物为免疫缺陷的非人动物。6.根据权利要求1
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5任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含的B2M蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：a)SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的全部或部分；b)与SEQ ID NO：40所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与SEQ ID NO：40所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或d)与SEQ ID NO：40所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。7.根据权利要求1
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6任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含的FcRn蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：a)SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的全部或部分；b)与SEQ ID NO：41所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与SEQ ID NO：41所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或d)与SEQ ID NO：41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。8.根据权利要求1
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7任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含的信号肽的氨基酸序列包含下列组中的一种：a)SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的全部或部分；b)与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
d)与SEQ ID NO：42所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。9.根据权利要求1
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8任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含下列组中的一种：a)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的全部或部分；b)与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或d)与SEQ ID NO：6所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。10.一种嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含B2M基因和FcRn基因。11.根据权利要求10所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分；优选的，所述的嵌合基因包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列；或者，所述的嵌合基因包含B2M基因的CDS序列，优选的，不含编码信号肽的CDS序列。12.根据权利要求10或11所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含FcRn基因的全部或部分，优选的，所述的嵌合基因包含FcRn基因的1号至7号外显子。13.根据权利要求10
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12任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含编码FcRn蛋白胞外区、跨膜区和胞质区的核苷酸序列，优选的，所述的嵌合基因还包含编码FcRn蛋白信号肽的核苷酸序列。14.根据权利要求10
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13任一所述的嵌合基因，其特征在于，B2M基因与FcRn基因的核苷酸序列之间直接或间接连接；优选为间接连接，进一步优选采用编码柔性linker的核苷酸序列连接；更进一步优选编码柔性linker的核苷酸序列连接B2M基因与FcRn基因的2号外显子。15.根据权利要求10
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14任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因编码权利要求1
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9任一所述的FcRn蛋白复合物。16.根据权利要求10
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15任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的B2M基因与FcRn基因分别独立来源于人或非人动物。17.根据权利要求10
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16任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因中B2M核苷酸序列包含下列组中的一种：(A)SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；(B)与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；(C)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或(D)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
18.根据权利要求10
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17任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因的DNA序列包含下列组中的一种：(A)SEQ ID NO：45所示核苷酸序列的全部或部分；(B)与SEQ ID NO：45所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；(C)与SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或(D)与SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。19.根据权利要求10
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18任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：(A)SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；(B)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，姚佳维，郭雅南，白阳，尚诚彰，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：