一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其含有抗生素耐药基因的结合位点，还含有通过ZF linker串联的锌指结构，并在其N端和C端连接有蛋白骨架。本发明专利技术还公开了所述蛋白在水环境中去除抗生素耐药基因中的应用，其中所述抗生素耐药基因优选磺胺类耐药基因sul1。实验证实本发明专利技术的蛋白能够特异性结合水环境中的抗生素耐药基因sul1，在模拟实际应用中的结合效率达到50％，预示其在水环境中对抗生素耐药基因的去除发挥显著作用，为解决无法在水环境中特异性去除耐药基因的不足奠定了实施基础，具有广阔的应用前景。用前景。用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白


[0001]本专利技术涉及一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]水环境中抗生素耐药基因的处理技术目前尚有许多不足，传统的污水处理技术(过滤，沉淀，厌氧消化)只能对水环境中的微生物和污染物进行去除，并不能去除其中的耐药基因；包括紫外线在内的氧化及高级氧化技术所需紫外的剂量很高，且不具备选择性；膜技术通过孔径大小对水环境中的污染物和耐药基因进行截留，使用过程中膜结垢问题严重且成本较高；电化学技术则需持续施加电场。
[0003]通过研究生物体内能够结合DNA的蛋白质的结构和功能之间的关系，人们开发了设计并合成能够结合特异序列DNA的技术。这些技术被用于体内基因编辑，实现了高效的基因组改造。锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)技术是基于锌指结构域设计的一种DNA结合与剪切技术。目前开发了可以特异性识别结合49种三联核苷酸(共有64种组合)的锌指结构域(Zinc Finger，ZF)。通过将识别不同三联核苷酸的ZF串联，人们可以构建出能够结合大多数特异DNA片段的人工蛋白。使用这一技术，可实现特异性地靶向结合DNA片段，使得利用该技术在水环境中特异去除抗生素耐药基因而不影响其他基因成为可能。经检索，有关能够特异性结合抗生素耐药基因sul1的新型人工合成蛋白及其应用还未见报道。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用。
[0005]本专利技术所述的能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其特征在于：所述蛋白含有抗生素耐药基因的结合位点，还含有通过ZF linker串联的锌指结构，并在其N端和C端连接有蛋白骨架。
[0006]上述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白优选的实施方式是：所述人工合成蛋白含有能够特异性识别抗生素耐药基因sul1的结合位点，还含有通过ZF linker串联的6个锌指结构，并在其N端和C端连接有SP1C蛋白骨架，该人工合成蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该人工合成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述抗生素耐药基因sul1结合位点的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述SP1C蛋白骨架是：N
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term backbone：YKCPECGKSFS，C
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term backbone：HQRTH，ZF linker：TGEKP，N
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term fixed：LEPGEKP，C
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term fixed：TGKKTS。
[0007]上述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白的获取方法是：先对耐药基因sul1特异结合位点序列进行筛选确定，得到相应的锌指结构，并将锌指结构进行串联，并在N，C端连接蛋白骨架，将编码该蛋白的核酸进行人工合成，然后通过酶切连接的方法将其连接到表达载体pET
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21b，并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达，最后通过镍柱亲和层
析，离子交换层析方法分离获得高纯度能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，命名为sul1结合蛋白。进一步经EMSA和ITC实验证实该人工合成蛋白可以和sul1基因特异结合。
[0008]本专利技术所述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白在水环境中去除抗生素耐药基因中的应用，其中所述抗生素耐药基因是指磺胺类耐药基因sul1，林可酰胺类耐药基因，氨基糖苷类耐药基因，喹诺酮类耐药基因，大环内酯类耐药基因，beta
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内酰胺类耐药基因，四环素类耐药基因，糖肽类耐药基因，恶唑烷酮类耐药基因，多肽类耐药基因，氨基香豆素类耐药基因，核苷酸类耐药基因，利福平类耐药基因，甲氧苄啶类(二氨基嘧啶类)耐药基因，氯霉素类耐药基因，有机砷类耐药基因，多胺类耐药基因，芬尼法霉素类耐药基因，截短侧耳素类耐药基因，游离脂肪酸类耐药基因，碳青霉烯类耐药基因，脂肽类耐药基因，大环类耐药基因，生物碱类耐药基因，安莎霉素类耐药基因，醌类耐药基因，去污剂类耐药基因，萜类耐药基因，离子通道类耐药基因，金属通道类耐药基因，砜类耐药基因，聚酮类耐药基因，二芳基喹啉类耐药基因，硝基呋喃类耐药基因，硝基咪唑类耐药基因。
[0009]其中，优选的实施方式是所述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白在水环境中去除磺胺类耐药基因sul1中的应用。该应用是利用本专利技术所述新型人工合成蛋白与sul1基因结合位点能够特异性结合的原理对水环境中的sul1耐药基因进行特异性结合并去除。
[0010]具体的应用方法是：将SEQ ID NO.2所示的人工合成蛋白通过固定化的方法固定于琼脂糖凝胶上并装填成柱，让含有抗生素耐药基因的水流经该凝胶柱，人工合成蛋白会特异性结合水环境中的磺胺类耐药基因sul1并相应去除；同时构建标准质粒进行qPCR标准曲线的制备，将含有抗生素耐药基因的水流过柱子，对流经前后的水样进行qPCR定量，确定水环境中sul1耐药基因的实际结合效率；其中，所述装填成柱的方法是将琼脂糖凝胶4FF经过环氧氯丙烷，硫代硫酸钠和DTT处理之后使其带有巯基，然后将琼脂糖凝胶4FF和新型人工合成蛋白的半胱氨酸通过二硫键进行共价交联，装填成柱；所述标准质粒是命名为pET
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STD的含磺胺类耐药基因sul1 PCR产物的质粒。
[0011]本专利技术公开了一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用。本专利技术中设计了一种能够特异性结合抗生素耐药基因sul1的新型人工合成蛋白，所述的新型人工合成蛋白是选取耐药基因的特异序列，进行设计并合成编码基因，通过E.coli BL21(DE3)进行原核表达后，利用亲和层析，离子交换层析等蛋白质纯化手段，最终获得高纯度，高表达量的新型人工合成蛋白。通过对该蛋白与相应的耐药基因的相互作用从而证明了该蛋白在能够结合水环境中的抗生素耐药基因sul1，在模拟实际应用中发现本专利技术所述人工蛋白与抗生素耐药基因的结合效率达到50％，预示其在水环境中对抗生素耐药基因的去除发挥显著作用。
[0012]本专利技术所述的能够特异性结合抗生素耐药基因sul1的新型人工合成蛋白制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实结合效率好，可以解决无法在水环境中特异性去除耐药基因的不足，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0013]图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果。
[0014]其中：M为marker(从上到下分别为15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp)；左四泳道为T7标准引物得到的PCR产物，模板为转化后随机挑选的E.coli BL21阳性克隆。后续会进行测序判断该人工合成蛋白的核酸序列是否正确。
[0015]图2为纯化后本专利技术所述人工合成蛋白的SDS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其特征在于：所述蛋白含有抗生素耐药基因的结合位点，还含有通过ZF linker串联的锌指结构，并在其N端和C端连接有蛋白骨架。2.根据权利要求1所述的能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其特征在于：所述人工合成蛋白含有能够特异性识别抗生素耐药基因sul1的结合位点，还含有通过ZF linker串联的6个锌指结构，并在其N端和C端连接有SP1C蛋白骨架，该人工合成蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该人工合成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述抗生素耐药基因sul1结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SP1C蛋白骨架是：N
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term backbone：YKCPECGKSFS，C
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term backbone：HQRTH，ZF linker：TGEKP，N
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term fixed：LEPGEKP，C
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term fixed：TGKKTS。3.权利要求1所述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白在水环境中去除抗生素耐药基因中的应用，其中所述抗生素耐药基因是指磺胺类耐药基因sul1，林可酰胺类耐药基因，氨基糖苷类耐药基因，喹诺酮类耐药基因，大环内酯类耐药基因，beta
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内酰胺类耐药基因，四环素类耐药基因，糖肽类耐药基因，恶唑烷酮类耐药基因，多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明钰，徐海，房萌，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：