一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质及其制备方法，特点是该装甲RNA的表达载体为pET32a

【技术实现步骤摘要】
一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种装甲RNA标准物质，尤其是涉及一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质及其制备方法。

技术介绍

[0002]据世界卫生组织报告，全球森林脑炎每年的发病大约2万例。近年来我国每年被蜱叮咬引发森林脑炎病例数也显著上升。森林脑炎病毒（Tick
‑
borne Forest Encephalitis virus,TBEV）属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属（Flavivirus）病毒。森林脑炎病毒的主要传播媒介是蜱，传染源为野生鼠类、刺猬等。蜱虫吸食受感染动物的血后病毒在蜱虫体内中繁殖，被带病毒的蜱虫咬后，人和其他动物引起感染。我国的内蒙古、黑龙江、吉林为森林脑炎病毒的主要流行地区，主要集中在大小兴安岭、长白山地区的森林高覆盖地区。目前对森林脑炎诊断包括病毒基因检测，间接荧光法和酶联免疫法检测森林脑炎病毒特异性IgM和IgG抗体。以荧光定量PCR技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，有助于对森林脑炎病毒的流行进行防控。
[0003]核酸检测必须使用质控品进行质量控制，目前RNA病毒的质控品主要病毒颗粒、裸露的RNA片段和装甲RNA。病毒颗粒包括减毒、灭活病毒或疫苗。目前，森林脑炎病毒有灭活疫苗“森张”株。但由于病毒制备和灭活需在高规格生物安全实验室内进行同时由于运输保存、及使用规格等限制其作为质控标准物质的应用。目前国内市面在森林脑炎病毒检测试剂盒一般采用合成质粒或RNA作为阳性对照，RNA模板容易在环境中受到RNase酶降解， DNA模板无法参与核酸提取过程和反转录过程，不能对检测的全过程进行监控。目前，以噬菌体为基础的内嵌核酸病毒盔甲颗粒因其与全病毒颗粒最为接近，已成为标准物质研制的一个热点。大肠杆菌MS2噬菌体包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性的相互作用，在噬菌体外壳组装的同时将噬菌体基因RNA包装到包膜内，而噬菌体的外壳可以耐受RNase，因此将MS2噬菌体相应cDNA序列克隆至原核表达载体并插入特定病毒序列，经转录、翻译噬菌体衣壳蛋白组装成病毒样颗粒，具备RNase抗性便于存储和运输。目前，国内外还没有公开关于森林脑炎病毒装甲RNA标准物质及其制备方法的相关研究报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有稳定、安全、耐核糖核酸且可用于森林脑炎病毒检测的质量控制的森林脑炎病毒装甲RNA标准物质及其制备方法。
[0005]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质，该装甲RNA的表达载体为pET32a
‑
CP
‑
C质粒，质粒包含噬菌体MS2 CP蛋白序列片段以及森林脑炎病毒C蛋白序列片段。
[0006]上述森林脑炎病毒装甲RNA标准物质的制备方法，包括以下步骤：（1）噬菌体MS2 CP基因扩增根据噬菌体MS2 CP蛋白序列片段设计特异性扩增引物，扩增引物序列如下所示：
CP P1：5
′‑
GGTACCGGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTG
‑3′
，CP P2：5
′‑
TTCCAGTAGCGACAGAAGCAAAAGCTTCC
‑3′ꢀ
；以MS2 噬菌体序列片段质粒为载体，通过引物CP P1和引物CP P2扩增获得噬菌体MS2 CP基因，其基因序列如SEQ ID NO:3所示；（2）表达载体pET32a
‑
CP的构建将PCR扩增产物噬菌体MS2 CP基因和原核表达载体pET
‑
32a双酶切，使用质粒纯化试剂盒纯化回收目的片段后并连接，将连接质粒转化感受态细胞进行蓝白斑筛选，在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，提取质粒获得表达载体pET32a
‑
CP；（3）森林脑炎病毒C蛋白序列合成人工合成森林脑炎病毒衣壳蛋白C基因组序列，并在序列5
’
端和3
’
端分别插入BamHI和Not I酶切位点，序列如SEQ ID NO:4所示，将合成的森林脑炎病毒衣壳蛋白C插入到pBluescript II SK+载体中，获得目的序列片段pBSK
‑
C；（4）表达载体pET32a
‑
CP
‑
C构建将pET32a
‑
CP和pBSK
‑
C均使用BamHI 、Not I双酶切，1.5wt%琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收pET32a
‑
CP和森林脑炎病毒衣壳蛋白C序列片段，连接后转化DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，提取质粒获得森林脑炎病毒装甲RNA表达载体 pET32a
‑
CP
‑
C；（5）森林脑炎病毒装甲RNA制备将森林脑炎病毒装甲RNA表达载体 pET32a
‑
CP
‑
C转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，离心收集菌体，超声波破碎后离心取上清，即获得森林脑炎病毒装甲RNA标准物质。
[0007]步骤（2）具体为：将PCR扩增产物噬菌体MS2 CP基因和原核表达载体pET
‑
32a双酶切， 37℃酶切1h，使用质粒纯化试剂盒纯化回收酶切后的目的片段，用DNA 连接试剂盒连接，连接体系：Ligation MiX 10
µ
L、CP 8
µ
L，pET32a 2
µ
，4℃过夜反应，将连接质粒转化感受态细胞进行蓝白斑筛选，在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种2mL 于LB液体培养基，37℃过夜培养，提取质粒，即得到表达载体pET32a
‑
CP，其中酶切反应体系如下：10
ꢀ×
K Buffer 1
µ
L、15units/
µ
L BamHI 1
µ
L 、10units/
µ
L Kpn I 1
µ
L，PCR产物/pET32a质粒1
µ
L，DDw 16
µ
L，37℃酶切1h。
[0008]步骤（4）具体为：将pET32a
‑
CP和pBSK
‑
C质粒使用BamHI 、Not I双酶切，1.5wt%琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收森林脑炎病毒衣壳蛋白C片段以及pET32a
‑
CP片段，将酶切回收的蛋白C片段和pET32a
‑
CP片段连接，连接条件反应体系：Ligation MiX 10
µ
L、pET32a
‑
CP 2
µ
L，C 8
µ
L，4℃过夜反应；将连接质粒转化DH5α感受态细胞进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质，其特征在于：该装甲RNA的表达载体为pET32a
‑
CP
‑
C质粒，质粒包含噬菌体MS2 CP蛋白序列片段以及森林脑炎病毒C蛋白序列片段。2.一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）噬菌体MS2 CP基因扩增根据噬菌体MS2 CP蛋白序列片段设计特异性扩增引物，扩增引物序列如下所示：CP P1：5
′‑
GGTACCGGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTG
‑3′
，CP P2：5
′‑
TTCCAGTAGCGACAGAAGCAAAAGCTTCC
‑3′ꢀ
；以MS2 噬菌体序列片段质粒为载体，通过引物CP P1和引物CP P2扩增获得噬菌体MS2 CP基因，其基因序列如SEQ ID NO:3所示；（2）表达载体pET32a
‑
CP的构建将PCR扩增产物噬菌体MS2 CP基因和原核表达载体pET
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32a双酶切，使用质粒纯化试剂盒纯化回收目的片段后并连接，将连接质粒转化感受态细胞进行蓝白斑筛选，在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，提取质粒获得表达载体pET32a
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CP；（3）森林脑炎病毒C蛋白序列合成人工合成森林脑炎病毒衣壳蛋白C基因组序列，并在序列5
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端和3
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端分别插入BamHI和Not I酶切位点，序列如SEQ ID NO:4所示，将合成的森林脑炎病毒衣壳蛋白C插入到pBluescript II SK+载体中，获得目的序列片段pBSK
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C；（4）表达载体pET32a
‑
CP
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C构建将pET32a
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CP和pBSK
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C均使用BamHI 、Not I双酶切，1.5wt%琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收pET32a
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CP和森林脑炎病毒衣壳蛋白C序列片段，连接后转化DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，提取质粒获得森林脑炎病毒装甲RNA表达载体 pET32a
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CP
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C；（5）森林脑炎病毒装甲RNA制备将森林脑炎病毒装甲RNA表达载体 pET32a
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CP
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C转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，离心收集菌体，超声波破碎后离心取上清，即获得森林脑炎病毒装甲RNA标准物质。3.根据权利要求2所述的一种森林脑炎病毒装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于步骤（2）具体为：将PCR扩增产物噬菌体MS2 CP基因和原核表达载体pET
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32a双酶切， 37℃酶切1h，使用质粒纯化试剂盒纯化回收酶切后的目的片段，用DNA 连接试剂盒连接，连接体系：Lig...

【专利技术属性】
技术研发人员：马思杰，胡群，童淑梅，邹春颖，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：