一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用技术

本发明专利技术公开一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物，所述特异性引物为两对为包括正向引物D.sp

【技术实现步骤摘要】
一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用


[0001]本专利技术涉及DNA分子标记
，具体涉及一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用。

技术介绍

[0002]我国是猕猴桃驯化品种的起源地和野生品种多样性中心，具有得天独厚的丰富自然资源。近年来，猕猴桃产业发展迅速。据2019年7月联合国粮农组织统计，截止到2017年底，我国猕猴桃采收面积和产量均稳居世界第一位，在世界猕猴桃产业发展中都占有举足轻重的地位。
[0003]猕猴桃属于呼吸跃变型果实，有明显的生理后熟过程，采后极易变软腐烂，不耐贮藏。猕猴桃软腐病是发生在果实贮藏期的最常见的真菌性病害，发病初期果实外表无明显症状，随着病情发展，发病部位表皮开始变软，微微凹陷，病斑中心果肉呈乳白色，周围果肉呈黄绿色透明状，7天左右果实完全腐烂，并产生刺鼻的气味。猕猴桃软腐病在世界各个主产国，如新西兰，智利，韩国，意大利，伊朗及我国都有过相应报道，最高发病率最高达68％。猕猴桃软腐病分布广，发病快，发病率高，造成严重的经济损失，且有逐年加重的趋势，对猕猴桃产业发展产生严重威胁。
[0004]目前报道的猕猴桃软腐病病原菌有葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，拟茎点霉菌 Phomopsis spp.(有性态Diaporthe spp.)，灰霉菌Botrytis cinerea，链格孢菌Alternaria spp.，青霉菌Penicillium spp.等等，其中葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和拟茎点霉菌Phomopsisspp.(有性态Diaporthe spp.)为主要致病菌。目前，猕猴桃软腐病病原菌的检测鉴定主要依赖于传统的病原菌分离鉴定，主要包括症状观察、病原菌分离、显微形态观察及分子鉴定等，耗时较长，极不利于猕猴桃软腐病的早期检测及预防。PCR检测是最常用的一种分子生物学检测方法，可通过快速扩增病原微生物的特异性核酸序列，实现病原菌的快速检测，近年来已在传染病、食源性致病菌污染、环境污染、肿瘤遗传标记等领域广泛应用，是比较成熟且应用范围最广的检测技术。但是现有的PCR检测猕猴桃软腐病病原菌的引物特异性不够高，检测的准确度比较低。
[0005]鉴于上述缺陷，本专利技术创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决目前没有快速检测猕猴桃软腐病病原的菌拟茎点霉属的特异性引物，现有PCR检测的准确度低、特异性不高的问题，提供了一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物，所述特异性引物为两对，第一对引物为正向引物D.sp
‑
29和反向引物D.sp
‑
485，第二对引物为正向引物D.sp
‑
140和反向引物D.sp
‑
506，其序列分别为：
[0008]D.sp
‑
29：5
′‑
CCCTTTGTGAACTTATACCTT
‑3′
；
[0009]D.sp
‑
485：5
′‑
CAGGGCACCGCCAGGGCCTTCCAG
‑3′
；
[0010]D.sp
‑
140：5
′‑
TTGTTTTTACACTGAAACTCTG
‑3′
；
[0011]D.sp
‑
506：5
′‑
AAGTTGGGGGTTTAACGGCA
‑3′
。
[0012]所述第一对引物针对拟茎点霉属特异性扩增片段大小为456bp，所述第二队引物针对拟茎点霉属特异性扩增片段大小为366bp。
[0013]本专利技术还公开了一种采用上述特异性引物通过PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，包括以下步骤：
[0014]S1：提取待检测样品DNA；
[0015]S2：以待测样品为DNA为模板，分别采用两对引物进行PCR扩增；
[0016]S3：扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。
[0017]所述步骤S1中提待检测样品DNA的具体步骤如下：
[0018]S11：称取待检测样品1g左右，加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末，将细末转移至2mL 离心管中，加入600μL预热至65℃的2
×
CTAB，颠倒混匀，65℃水浴45～60min；
[0019]S12：取出离心管冷却至室温，加入600μL氯仿：异戊醇溶液，振荡混匀，10000rpm离心10min，取上清液至另一1.5mL离心管中，再加入等体积氯仿：异戊醇溶液，10000rpm离心10min；
[0020]S13：取上清液至另一1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，
ꢀ‑
20℃放置1h，10000rpm离心10min；
[0021]S14：去掉上清液，加入70％无水乙醇清洗2次，室温干燥后用适量无菌ddH2O溶解沉淀的DNA，
‑
20℃保存备用。
[0022]所述步骤S11中2
×
CTAB含2％巯基乙醇和2％的PVPP。
[0023]所述步骤S12中氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
[0024]所述步骤S2中PCR扩增的反应体系总体积为25μL，包括10
×
Taq PCR buffer 2.5μL， 2.5mmol/L dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，无菌ddH2O 13μL。
[0025]所述步骤S2中PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃总延伸5min。
[0026]所述步骤S3中琼脂糖凝胶电泳采用1％的琼脂糖凝胶，采用120V恒压电泳15min。
[0027]与现有技术比较本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供两对用于快速检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉属的特异性引物及其检测方法，可以快速检测猕猴桃中拟茎点霉属的存在，检测准确度和特异性高，并分别能在接种拟茎点霉菌后早期检测到病原菌，达到猕猴桃软腐病早期检测的目的，对于猕猴桃软腐病的早期检测，预防和控制具有非常重要的意义和经济意义。
附图说明
[0028]图1为引物特异性的PCR检测结果图，(a)为引物D.sp
‑
29/D.sp
‑
485的引物特异性，(b) 为引物D.sp
‑
140/D.sp
‑
506的引物特异性；
[0029]图2为引物准确性的PCR检测结果图，(a)为引物D.sp
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为两对为包括正向引物D.sp
‑
29和反向引物D.sp
‑
485的第一对引物或包括正向引物D.sp
‑
140和反向引物D.sp
‑
506的第二对引物，其序列分别为：D.sp
‑
29：5
′‑
CCCTTTGTGAACTTATACCTT
‑3′
；D.sp
‑
485：5
′‑
CAGGGCACCGCCAGGGCCTTCCAG
‑3′
；D.sp
‑
140：5
′‑
TTGTTTTTACACTGAAACTCTG
‑3′
；D.sp
‑
506：5
′‑
AAGTTGGGGGTTTAACGGCA
‑3′
。2.如权利要求1所述的一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物，其特征在于，所述第一对引物针对拟茎点霉属特异性扩增片段大小为456bp，所述第二对引物针对拟茎点霉属特异性扩增片段大小为366bp。3.一种采用如权利要求1或2所述的特异性引物PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：提取待检测样品DNA；S2：以待测样品为DNA为模板，分别采用两对引物进行PCR扩增；S3：扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。4.如权利要求3所述的一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中提待检测样品DNA的具体步骤如下：S11：称取待检测样品1g左右，加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末，将细末转移至离心管中，加入600μL预热至65℃的2
×...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永胜，李欢欢，苗敏，刘奎，刘洪林，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：