一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺制造技术

本公开提供一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其包括步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理，步骤2重组蛋白的捕获，以及步骤3离子交换层析色谱精制；其中所述步骤2重组蛋白的捕获是将工程菌菌体匀浆处理液上样至镍亲和柱，通过改变咪唑浓度洗脱目的蛋白，同时加入0.3mol/L NaCl来减少由于电荷作用引起的非特异性吸附。所述方法重复性好、得率高，能获得纯度接近100%的葡激酶，适合制药工业大规模生产。产。产。

【技术实现步骤摘要】
一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺


[0001]本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，特别是涉及针对可溶性表达重组葡激酶突变体的大肠杆菌进行匀浆、亲和纯化以及离子交换精制获得重组葡激酶突变体的方法。

技术介绍

[0002]葡激酶(staphylokinase,Sak)，Sak是由溶原性金黄色葡萄球菌分泌的一种蛋白水解酶。由于葡激酶分泌的量极少，而且直接利用金黄色葡萄球菌发酵，易被金黄色葡萄球菌自身产生的内毒素污染，不仅产量低而且纯化步骤复杂。20世纪80年代初，Sako T等从金黄色葡萄球菌中提取到含葡激酶基因的S
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C噬菌体片段，通过酶切将葡激酶基因连接到Pbr322裁体上，再转化到宿主菌中，成功地筛选到可分泌葡激酶的克隆菌，并对葡激酶基因核苷酸序列进行了分析，通过对重组质粒载体改造得到了葡激酶工程菌，并对重组葡激酶进行了分离纯化。在这之后，Behnke D和Gerlach D等利用上述类似的方法从噬菌体42D筛选到葡激酶基因，并成功地在大肠杆菌和枯草杆菌中克隆表达。利用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其包括：步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理，步骤2重组蛋白的捕获，步骤3离子交换层析精制；其中，所述步骤2重组蛋白的捕获是将工程菌菌体匀浆处理液上样至镍亲和柱，通过改变咪唑浓度洗脱目的蛋白，同时加入0.3mol/L NaCl来减少由于电荷作用引起的非特异性吸附。2.如权利要求1所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理包括：（1）离心获得表达mSAK的重组大肠杆菌菌泥；（2）将重组大肠杆菌菌泥与重悬缓冲液按1：10（g：mL）的比例重悬，所述重悬缓冲液为20mmol/L Tris
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HCl pH 7.5；（3）匀浆机800bar匀浆2次，10000g离心40min取上清；（4）向步骤（3）的离心上清液中加入0.3mol/L NaCl，0.01mol/L咪唑，10000g离心40min取上清。3.如权利要求1所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于步骤2重组蛋白的捕获包括：采用Chelating Ni
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层析柱，控制上样载量10mg/ml左右；平衡缓冲液为50mmol/L Tris
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【专利技术属性】
技术研发人员：田赵源，范敏，陆游，于东安，游猛，谭小钉，梅菲，王宇，钱子俊，
申请(专利权)人：江苏迈威康新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：