一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺制造技术

本公开提供一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其包括步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理，步骤2重组蛋白的捕获，以及步骤3离子交换层析色谱精制；其中所述步骤2重组蛋白的捕获是将工程菌菌体匀浆处理液上样至镍亲和柱，通过改变咪唑浓度洗脱目的蛋白，同时加入0.3mol/L NaCl来减少由于电荷作用引起的非特异性吸附。所述方法重复性好、得率高，能获得纯度接近100%的葡激酶，适合制药工业大规模生产。产。产。

【技术实现步骤摘要】
一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺


[0001]本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，特别是涉及针对可溶性表达重组葡激酶突变体的大肠杆菌进行匀浆、亲和纯化以及离子交换精制获得重组葡激酶突变体的方法。

技术介绍

[0002]葡激酶(staphylokinase,Sak)，Sak是由溶原性金黄色葡萄球菌分泌的一种蛋白水解酶。由于葡激酶分泌的量极少，而且直接利用金黄色葡萄球菌发酵，易被金黄色葡萄球菌自身产生的内毒素污染，不仅产量低而且纯化步骤复杂。20世纪80年代初，Sako T等从金黄色葡萄球菌中提取到含葡激酶基因的S
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￥
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C噬菌体片段，通过酶切将葡激酶基因连接到Pbr322裁体上，再转化到宿主菌中，成功地筛选到可分泌葡激酶的克隆菌，并对葡激酶基因核苷酸序列进行了分析，通过对重组质粒载体改造得到了葡激酶工程菌，并对重组葡激酶进行了分离纯化。在这之后，Behnke D和Gerlach D等利用上述类似的方法从噬菌体42D筛选到葡激酶基因，并成功地在大肠杆菌和枯草杆菌中克隆表达。利用基因工程技术，高效表达重组葡激酶不仅产量高，而且免疫原性较小，为重组葡激酶产业化和临床应用奠定了良好的基础。
[0003]成熟的葡激酶分子中含有136个氨基酸，相对分子质量为1．6
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104～2．25
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104，肽链中没有二硫键，对其溶液中的构象研究表明，分子中有两个相似大小的结构域，分子形状类似两头易变的“哑铃”。其等电点为6．8，半衰期为6～7 rain。成熟的葡激酶容易降解，N末端常缺少6或10个氨基酸残基，但降解的葡激酶活性不受影响。
[0004]葡激酶是一种对纤维蛋白高度专一的纤溶蛋白酶原激活物，它与纤溶酶原以1：1等分子结合，形成无活性的纤溶酶原葡激酶复合物，再以限速步骤产生有活性的纤溶酶葡激酶复合物。其作用机制完全不同于以往临床使用的以直接方式发挥作用的纤溶酶原激活剂如尿激酶等，葡激酶作用过程中不伴有蛋白裂解。纤溶酶原葡激酶复合物的形成，暴露了纤溶酶原分子结构中的赖氨酸活性部位，使纤溶酶原变成纤溶酶，从而发挥纤溶活性。正常情况下，血浆中存在a2抗纤溶酶，可与纤溶酶葡激酶复合物上的赖氨酸活性部位迅速结合，形成新的相对分子质量更大的无活性复合物，导致纤溶酶原不能形成纤溶酶，因此，正常状态下，葡激酶并不能激活血液中的纤溶系统。而在遇到血栓中的纤维蛋白时，大复合物中的a2
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抗纤溶酶通过纤维蛋白稳定因子与纤维蛋白连接，使a2
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抗纤溶酶对纤溶酶葡激酶复合物的抑制减少100倍以上，纤溶酶葡激酶复合物通过赖氨酸结合部位结合到纤维蛋白上，并在该部位表现出显著活性，从而消化纤维蛋白。Jetrea在专利US7445775中公开，葡激酶突变体SY162是在野生型SAK的基础上突变了12个氨基酸（K35A, E65Q, K74R, E80A, D82A, T90A, E99D, T101S, E108A, K109A, K130T和K135R），降低了野生型SAK的免疫原性。野生型SAK及其突变体序列见附件序列表。

技术实现思路

[0005]本公开提供一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其包括步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理，步骤2重组蛋白的捕获，以及步骤3离子交换层析色谱精制；其中所述步骤2重组蛋白的捕获是将工程菌菌体匀浆处理液上样至镍亲和柱，通过改变咪唑浓度洗脱目的蛋白，同时加入0.3mol/L NaCl来减少由于电荷作用引起的非特异性吸附。所述方法重复性好、得率高，能获得纯度接近100%的葡激酶，适合制药工业大规模生产。
[0006]mSAK的纯化制备工艺流程主要分为五步：第一步进行发酵菌泥重悬后匀浆，确定了匀浆条件以及匀浆后处理方式；第二步进行蛋白捕获，分别比较硫酸铵分级沉淀和Chelating Ni2+金属螯合层析法，确定最佳捕获方法；第三步考察Chelating Ni2+层析中洗脱条件和载量对蛋白得率和纯度的影响；第四步考察Q层析中洗脱液、洗脱方式、载量对蛋白得率和纯度的影响；最后进行mSAK纯化工艺稳定性的考察。
[0007]具体而言：一方面，本专利技术涉及一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其包括：步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理，步骤2重组蛋白的捕获，步骤3离子交换层析精制；其中，所述步骤2重组蛋白的捕获是将工程菌菌体匀浆处理液上样至镍亲和柱，通过改变咪唑浓度洗脱目的蛋白，同时加入0.3mol/L NaCl来减少由于电荷作用引起的非特异性吸附。
[0008]进一步，本专利技术所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理包括：（1）离心获得表达mSAK的重组大肠杆菌菌泥；（2）将重组大肠杆菌菌泥与重悬缓冲液按1：10（g：mL）的比例重悬，所述重悬缓冲液为20mmol/L Tris
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HCl pH 7.5；（3）匀浆机800bar匀浆2次，10000g离心40min取上清；（4）向步骤（3）的离心上清液中加入0.3mol/L NaCl，0.01mol/L咪唑，10000g离心40min取上清。
[0009]进一步，本专利技术所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于步骤2重组蛋白的捕获包括：采用Chelating Ni2+层析柱，控制上样载量10mg/ml左右；平衡缓冲液为50mmol/L Tris
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HCl+0.3mol/L NaCl+0.01mol/L 咪唑 pH7.5；洗脱缓冲液为50mmol/L Tris
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HCl+0.3mol/L NaCl+0.5mol/L 咪唑 pH7.5；以8%洗脱缓冲液的梯度预洗脱除去结合较弱的杂蛋白，以15%洗脱缓冲液的梯度洗脱回收目的蛋白，以100%洗脱缓冲液的梯度洗脱结合较强的杂蛋白并再生层析柱。
[0010]进一步，本专利技术所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于步骤3离子交换层析精制包括：采用Q FF层析柱，控制上样载量10
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15mg/ml左右；平衡缓冲液为20mmol/L Tris
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HCl，pH 7.5；
以20mmol/L PB pH 6.5的预洗脱液除去杂蛋白，以50mmol/L NaAc/HAc pH5.5洗脱目的蛋白，以0.5mol/L NaOH清洗层析柱。
[0011]进一步，本专利技术所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于在步骤2重组蛋白的捕获和步骤3离子交换层析精制之间还包括对捕获的重组葡激酶突变体进行脱盐的步骤。
[0012]另一方面，本专利技术提供前述任一方法在制备葡激酶活性药物中的用途。
[0013]为更好理解本专利技术，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
[0014]术语“葡激酶”， 是从金黄色葡萄球菌中分离出来的一种能够特异性溶解血栓的酶类物质。葡激酶是纤维蛋白特异的溶栓药物，与血栓中的纤维蛋白有较高的亲和力，它能在血栓的部位与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其包括：步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理，步骤2重组蛋白的捕获，步骤3离子交换层析精制；其中，所述步骤2重组蛋白的捕获是将工程菌菌体匀浆处理液上样至镍亲和柱，通过改变咪唑浓度洗脱目的蛋白，同时加入0.3mol/L NaCl来减少由于电荷作用引起的非特异性吸附。2.如权利要求1所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理包括：（1）离心获得表达mSAK的重组大肠杆菌菌泥；（2）将重组大肠杆菌菌泥与重悬缓冲液按1：10（g：mL）的比例重悬，所述重悬缓冲液为20mmol/L Tris
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HCl pH 7.5；（3）匀浆机800bar匀浆2次，10000g离心40min取上清；（4）向步骤（3）的离心上清液中加入0.3mol/L NaCl，0.01mol/L咪唑，10000g离心40min取上清。3.如权利要求1所述重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其特征在于步骤2重组蛋白的捕获包括：采用Chelating Ni
2+
层析柱，控制上样载量10mg/ml左右；平衡缓冲液为50mmol/L Tris
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【专利技术属性】
技术研发人员：田赵源，范敏，陆游，于东安，游猛，谭小钉，梅菲，王宇，钱子俊，
申请(专利权)人：江苏迈威康新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：