本发明专利技术公开了一种大肠杆菌生产SUMO酶的发酵工艺，发酵工艺：待发酵罐温度降至37℃，接入1L种子液和5ml卡那霉素，在罐压0.06MPa、温度37℃、PH7.0的条件下培养至OD
【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌生产SUMO酶的发酵工艺
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种SUMO酶的发酵工艺，具体为一种大肠杆菌生产SUMO酶的发酵工艺。
技术介绍
[0002]目前，蛋白产量及活性不高是异源蛋白表达尤其是毒性蛋白表达的技术瓶颈。随着生物技术的发展，研究者应用融合表达策略克服毒性及难溶性蛋白的表达难关。
[0003]自2004年以来，SUMO作为融合标签越来越多地用于表达系统中。SUMO比传统的融合标签如硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白等具有更大的优势，除了具有传统融合标签的促进可溶性的特性外，还具有分子伴侣功能，能促进目的蛋白的正确折叠等特点，同时对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋白的稳定性。
[0004]SUMO融合标签的更大的优势在于其具有与其配套的SUMO蛋白酶。SUMO蛋白酶具有较强的专一性，它所识别的区域并非其他丝氨酸蛋白酶或化学试剂的一级序列，而是蛋白质的三维结构，因此导致其切割效率高而且不具有非特异性。SUMO蛋白酶识别SUMO三级结构后，能从SUMO末端的双甘氨酸处将目的蛋白从融合蛋白上切割下来，不存在任何氨基酸残留，因而较适用于表达天然序列的重组蛋白。
[0005]SUMO蛋白酶能特应性地切割含SUMO位点的融合蛋白，SUMO蛋白酶切位点常被用于客户融合蛋白标签的切除。
[0006]目前，市场上SUMO蛋白酶，生物活性普遍较低，而且常见的SUMO蛋白酶发酵工艺，步骤繁琐，成本较高，产量低，现有的SUMO酶发酵工艺仅得到335mg/L产量。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的就在于为了解决目前，市场上SUMO蛋白酶，生物活性普遍较低，而且常见的SUMO蛋白酶发酵工艺，步骤繁琐，成本较高，产量低，现有的SUMO酶发酵工艺仅得到335mg/L产量的问题，而提出一种大肠杆菌生产SUMO酶的发酵工艺。
[0008]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0009]一种大肠杆菌生产SUMO酶的发酵工艺，包括以下步骤；
[0010]第一步：菌种活化：取3支已灭菌的试管，试管内装有4mlLB培养基，并分别向3支试管接入10μL菌种和2μL卡那霉素，然后在温度为37℃和转速为200rpm的条件下振荡培养；取出已灭菌的1.5mLEP管，并向EP管中加入500μL已灭菌的50％甘油；当试管中培养物OD
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＝0.6-0.8时，取出试管，从试管中取出500μL培养物加入至EP管中，将EP管放入-4℃保存，得到保种菌；
[0011]第二步：种子液制备：取2L三角瓶，加入1000mlLB培养基灭菌，接入500μL卡那霉素和1ml保种菌，在温度为37℃和转速为200rpm的条件下振荡培养至OD
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＝0.6-0.8，得到种子液；
[0012]第三步：补料培养基制备：按照以下重量份：甘油1-3％，酵母浸膏粉9-11g/L，胰蛋
白胨9-11g/L，MgSO45-7g/L配置2L的培养基，然后加入补料瓶高压灭菌，得到补料培养基备用；
[0013]第四步：发酵液制备：按照以下重量份：甘油1％，酵母浸膏粉24g/L，胰蛋白胨10-14g/L，K2HPO47.4-11.4g/L，KH2PO40.8-1.5g/L，MgSO41-3g/L，微量元素混合液0.5-1.5ml/L，消泡剂0.1-0.3ml/L配置9L的培养基，然后加入发酵罐中121℃高压灭菌20min；
[0014]第五步：发酵工艺：待发酵罐温度降至37℃，接入1L种子液和5ml卡那霉素，在罐压0.06MPa、温度37℃、PH7.0的条件下培养至OD
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＝3.0-3.5，然后将罐温降至16℃，在降温过程中搅拌转速和通气量以维持DO在28％-32％，待温度降至16℃，加入最终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，放罐后以8000rpm的速度离心10min收集培养基中的菌体进行纯化。
[0015]优选的，在第四步中，微量元素混合液由以下重量份原料组成:FeCL328-32g/L、ZnSO44.8-8.8g/L、CuSO44.8-8.8g/L、CaCL22.8-6.8g/L、VB10-14g/L、MnSO47.8-11.8g/L。
[0016]优选的，在第五步中，培养时通风比由0.5vvm提升至1.5vvm，搅拌转速由100rpm提升至500rpm。
[0017]优选的，在第五步中，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导的时间为16小时，诱导过程中根据养分消耗情况进行补料，保持DO在28％-32％，并根据菌体生长情况调节PH，维持PH6.7-7.0。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：菌种活化：取3支已灭菌的试管，试管内装有4mlLB培养基，并分别向3支试管接入10μL菌种和2μL卡那霉素，然后在温度为37℃和转速为200rpm的条件下振荡培养；取出已灭菌的1.5mLEP管，并向EP管中加入500μL已灭菌的50％甘油；当试管中培养物OD
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＝0.6-0.8时，取出试管，从试管中取出500μL培养物加入至EP管中，将EP管放入-4℃保存，得到保种菌：种子液制备：取2L三角瓶，加入1000mlLB培养基灭菌，接入500μL卡那霉素和1ml保种菌，在温度为37℃和转速为200rpm的条件下振荡培养至OD
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＝0.6-0.8，得到种子液：补料培养基制备：按照以下重量份：甘油1-3％，酵母浸膏粉9-11g/L，胰蛋白胨9-11g/L，MgSO45-7g/L配置2L的培养基，然后加入补料瓶高压灭菌，得到补料培养基备用；发酵液制备：按照以下重量份：甘油1％，酵母浸膏粉24g/L，胰蛋白胨10-14g/L，K2HPO47.4-11.4g/L，KH2PO40.8-1.5g/L，MgSO41-3g/L，微量元素混合液0.5-1.5ml/L，消泡剂0.1-0.3ml/L配置9L的培养基，然后加入发酵罐中121℃高压灭菌20min；使用的培养基添加的微量元素对维持培养基缓冲pH值、调节细胞渗透压、维持细胞代谢所需的营养成分具有重要作用：发酵工艺：待发酵罐温度降至37℃，接入1L种子液和5ml卡那霉素，在罐压0.06MPa、温度37℃、PH7.0的条件下培养至OD
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＝3.0-3.5，然后将罐温降至16℃，在降温过程中搅拌转速和通气量以维持DO在28％-32％，待温度降至16℃，加入最终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，放罐后以8000rpm的速度离心10min收集培养基中的菌体进行纯化，本专利技术的发酵工艺充分保证了细胞生长最适条件，最终SUMO蛋白酶获得了2400mg/L的产量,比国内同类研究的335mg/L产量高7倍。
具体实施方式
[0019]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌生产SUMO酶的发酵工艺，其特征在于：包括以下步骤；第一步：菌种活化：取3支已灭菌的试管，试管内装有4ml LB培养基，并分别向3支试管接入10μL菌种和2μL卡那霉素，然后在温度为37℃和转速为200rpm的条件下振荡培养；取出已灭菌的1.5mL EP管，并向EP管中加入500μL已灭菌的50％甘油；当试管中培养物OD
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＝0.6-0.8时，取出试管，从试管中取出500μL培养物加入至EP管中，将EP管放入-4℃保存，得到保种菌；第二步：种子液制备：取2L三角瓶，加入1000mlLB培养基灭菌，接入500μL卡那霉素和1ml保种菌，在温度为37℃和转速为200rpm的条件下振荡培养至OD
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＝0.6-0.8，得到种子液；第三步：补料培养基制备：按照以下重量份：甘油1-3％，酵母浸膏粉9-11g/L，胰蛋白胨9-11g/L，MgSO45-7g/L配置2L的培养基，然后加入补料瓶高压灭菌，得到补料培养基备用；第四步：发酵液制备：按照以下重量份：甘油1％，酵母浸膏粉24g/L，胰蛋白胨10-14g/L，K2HPO47.4-11.4g/L，KH2PO40.8-1.5g/L，MgSO41-3g/L，微量元素混合液0.5-1.5ml/L，消泡剂0.1-0.3ml/L配置9L的培养基，然后加入发酵罐中12...
【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，张伦，孙伟，韦伟洋，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：
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