用于改进的免疫疗法的组合基因靶标制造技术

本公开提供了与免疫效应细胞的提高治疗功效的修饰有关的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了经修饰以降低一种或多种内源靶基因的表达或降低内源蛋白的一种或多种功能来增强所述免疫细胞的效应子功能的免疫效应细胞。在一些实施方案中，提供了通过引入赋予抗原特异性的诸如外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的转基因进一步修饰的免疫效应细胞。还提供了使用本文所述的修饰的免疫效应细胞治疗诸如癌症的细胞增殖性病症的方法。胞治疗诸如癌症的细胞增殖性病症的方法。胞治疗诸如癌症的细胞增殖性病症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改进的免疫疗法的组合基因靶标
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2019年2月4日提交的美国临时专利申请号62/800,999；和2019年3月14日提交的美国临时专利申请号62/818,677的优先权，这些申请均以引用的方式整体并入本文。
[0003]电子提交的文本文件的描述
[0004]随此电子提交的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：70061_KSQW
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014_ST25.txt；记录日期：2020年2月4日；文件大小：945千字节)。


[0005]本公开涉及用于编辑靶核酸序列或调节靶核酸序列的表达的方法、组合物和组分，及其结合免疫疗法(包括与受体工程化的免疫效应细胞一起使用)在细胞增殖性疾病、炎性疾病和/或传染性疾病的治疗中的应用。

技术介绍

[0006]利用遗传修饰的T细胞(特别是CAR
‑
T细胞)的过继性细胞转移已经作为实体瘤和血液恶性肿瘤的治疗剂进入临床测试。迄今为止的结果是好坏参半。在血液恶性肿瘤(尤其是淋巴瘤、CLL和ALL)中，多数患者分别在1期和2期试验中表现出至少部分应答，其中一些表现出完全应答(Kochenderfer等人,2012Blood 1 19,2709
‑
2720)。在2017年，FDA批准了两种CAR
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T疗法Kymriah
TM
和Yescarta
TM
，它们均用于治疗血液癌症。然而，在大多数肿瘤类型(包括黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌)中，观察到较少的应答(Johnson等人,2009Blood 114,535
‑
546；Lamers等人,2013Mol.Ther.21,904
‑
912；Warren等人,1998Cancer Gene Ther.5,S1
‑
S2)。因此，过继性T细胞疗法仍有很大的改进空间，因为成功主要限于靶向B细胞谱系的血液恶性肿瘤的CAR
‑
T细胞方法。

技术实现思路

[0007]需要改进修饰的免疫细胞的过继性转移在癌症治疗中的功效，特别是提高过继性细胞疗法对实体恶性肿瘤的功效，因为在这些肿瘤类型中观察到应答降低(黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌；Yong,2017,Imm Cell Biol.,95:356
‑
363)。另外，即使在已经观察到过继性转移的益处的血液恶性肿瘤中，也并非所有患者都会做出应答，并且复发的发生频率高于期望的频率，这可能是由于过继性转移的T细胞功能减弱所致。
[0008]限制遗传修饰的免疫细胞作为癌症治疗剂的功效的因素包括：(1)细胞增殖，例如过继性转移后T细胞的有限增殖；(2)细胞存活，例如肿瘤环境因子诱导T细胞凋亡；和(3)细胞功能，例如由宿主免疫细胞和癌细胞分泌的抑制因子对细胞毒性T细胞功能的抑制，以及在制造过程中和/或转移后免疫细胞的耗竭。
[0009]被认为增加免疫细胞的抗肿瘤作用的具体特征包括细胞的以下能力：1)在过继性
转移后在宿主中增殖；2)浸润肿瘤；3)在宿主中持续存在和/或表现出对免疫细胞耗竭的抗性；和4)以能够杀伤肿瘤细胞的方式起作用。本公开提供了包含降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的免疫细胞，其中所述修饰的免疫细胞表现出一种或多种效应子功能的增强，其包括增加的增殖、增加的对肿瘤的浸润、免疫细胞在受试者中的持续存在和/或增加的对免疫细胞耗竭的抗性。本公开还提供了用于修饰免疫效应细胞以引发针对肿瘤细胞的增强的免疫细胞活性的方法和组合物，以及适用于过继性免疫细胞转移疗法的背景的方法和组合物。
[0010]在一些实施方案中，本公开提供了一种包含能够降低选自SOCS1、PTPN2和ZC3H12A的至少两种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统的修饰的免疫效应细胞，其中所述降低的至少两种内源靶基因的表达和/或功能增强免疫效应细胞的效应子功能。在一些实施方案中，所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2。在一些实施方案中，所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A。在一些实施方案中，所述至少两种靶基因是PTPN2和ZC3H12A。在一些实施方案中，基因调控系统还能够降低CBLB的表达和/或功能。
[0011]在一些实施方案中，基因调控系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白。在一些实施方案中，基因调控系统包含选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂(antagomiR)或反义RNA的核酸分子。在一些实施方案中，基因调控系统包含酶蛋白，并且其中所述酶蛋白已被工程化以特异性结合一种或多种内源基因中的靶序列。在一些实施方案中，蛋白质是转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶。在一些实施方案中，基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子，并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂。在一些实施方案中，Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂。在一些实施方案中，Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并与能够调节一种或多种内源靶基因表达的异源蛋白结合。在一些实施方案中，异源蛋白选自由MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Kr
ü
ppel相关盒(KRAB)结构域、甲基
‑
CpG结合蛋白2(MECP2)和四个串联的mSin3结构域(SID4X)组成的组。
[0012]在一些实施方案中，至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，并且其中基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向PTPN2的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列，所述靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列。在一些实施方案中，至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，并且其中基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向PTPN2的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列，所述靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，并且其中基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向PTPN2的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:7
‑
151组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰的免疫效应细胞，其包含能够降低选自SOCS1、PTPN2和ZC3H12A的至少两种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述降低的至少两种内源靶基因的表达和/或功能增强所述免疫效应细胞的效应子功能。2.如权利要求1所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2。3.如权利要求1所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A。4.如权利要求1所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是PTPN2和ZC3H12A。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统还能够降低CBLB的表达和/或功能。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白。7.如权利要求6所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA的核酸分子。8.如权利要求6所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含酶蛋白，并且其中所述酶蛋白已被工程化以特异性结合所述内源基因中的一种或多种中的靶序列。9.如权利要求8所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述蛋白质是转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶。10.如权利要求6所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子，并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。11.如权利要求10所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。12.如权利要求10所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白，并且能够诱导双链DNA断裂。13.如权利要求10所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体，并且能够诱导单链DNA断裂。14.如权利要求10所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)，并与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白结合。15.如权利要求14所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述异源蛋白选自由MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Kr
ü
ppel相关盒(KRAB)结构域、甲基
‑
CpG结合蛋白2(MECP2)和四个串联的mSin3结构域(SID4X)组成的组。16.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向PTPN2的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列，所述靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列。17.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基
因是SOCS1和PTPN2，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向PTPN2的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列，所述靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列。18.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向PTPN2的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:7
‑
151组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶向PTPN2的gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:185
‑
207组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。19.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向PTPN2的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:7
‑
151组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，所述靶向PTPN2的gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:185
‑
207组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。20.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列，所述靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列。21.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列，所述靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标中的任一个所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列。22.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:7
‑
151组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。23.如权利要求10
‑
15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子，所述靶向SOCS1的gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:7
‑
151组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，所述靶向ZC3H12A的gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
NO:7
‑
151组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，所述靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。31.如权利要求7所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子，所述靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸，所述靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸。32.如权利要求7所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子，所述靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，所述靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。33.如权利要求7所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA，所述靶向SOCS1的siRNA或shRNA包含与选自由SEQ ID NO:7
‑
151组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，所述靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA包含与选自由SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。34.如权利要求7所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是PTPN2和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子，所述靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸，所述靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸。35.如权利要求7所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是PTPN2和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子，所述靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，所述靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。36.如权利要求7所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是PTPN2和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA，所述靶向PTPN2的siRNA或shRNA包含与选自由SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，所述靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA包含与选自由SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
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30个核苷酸。37.如权利要求9所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，并且其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白和至少一种靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白，所述靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合由表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的靶DNA序列，所述靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合由表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的靶DNA序列。38.如权利要求9所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和PTPN2，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白和至少一种靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白，所述靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合选自SEQ ID NO:7
‑
151的DNA序列，所述靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
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375或SEQ ID NO:272
‑
308的DNA序列。39.如权利要求9所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白和至少一种靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白，所述靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合由表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的靶DNA序列，所述靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合由表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的靶DNA序列。40.如权利要求9所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是SOCS1和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白和至少一种靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白，所述靶向SOCS1的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合选自SEQ ID NO:7
‑
151的DNA序列，所述靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合选自SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
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575的DNA序列。41.如权利要求9所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是PTPN2和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白和至少一种靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白，所述靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合由表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的靶DNA序列，所述靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合由表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的靶DNA序列。42.如权利要求9所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种内源基因是PTPN2和ZC3H12A，其中所述基因调控系统包含至少一种靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白和至少一种靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白，所述靶向PTPN2的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308的DNA序列，所述靶向ZC3H12A的TALEN、锌指或大范围核酸酶蛋白结合选自SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575的DNA序列。43.如权利要求1
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42中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏引入所述免疫效应细胞。
44.如权利要求43所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统以编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。45.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自SOCS1、PTPN2和ZC3H12A的至少两种内源基因的表达和/或功能，其中所述降低的至少两种内源基因的表达和/或功能增强所述免疫效应细胞的效应子功能。46.如权利要求45所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2。47.如权利要求45所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A。48.如权利要求45所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是PTPN2和ZC3H12A。49.一种修饰的免疫效应细胞，其在选自SOCS1、PTPN2和ZC3H12A的至少两种内源基因中包含失活突变。50.如权利要求49所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或CAR
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T细胞。51.如权利要求49或权利要求50所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2。52.如权利要求49或权利要求50所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A。53.如权利要求49或权利要求50所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是PTPN2和ZC3H12A。54.如权利要求49
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53中任一项所述的修饰的细胞，其中所述失活突变包括在所述两种或更多种内源基因的基因组序列中缺失、取代或插入一个或多个核苷酸。55.如权利要求54所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述缺失是所述两种或更多种内源靶基因的部分或完全缺失。56.如权利要求54所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变是移码突变。57.如权利要求49
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56中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变降低所述两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。58.如权利要求45
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57中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其还包含降低的CBLB的表达和/或功能。59.一种修饰的免疫效应细胞，其包含编码选自SOCS1、PTPN2和ZC3H12A的至少两种内源靶基因的至少两种核酸抑制剂的一种或多种外源多核苷酸。60.如权利要求59所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或CAR
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T细胞。61.如权利要求59或权利要求60所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2。62.如权利要求59或权利要求60所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A。63.如权利要求59或权利要求60所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种靶基
因是PTPN2和ZC3H12A。64.如权利要求59
‑
63中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述至少两种核酸抑制剂降低所述两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。65.如权利要求58或权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中与未修饰的或对照的免疫效应细胞相比，所述两种或更多种内源靶基因的表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。66.如权利要求65所述的修饰的免疫效应细胞，其中与未修饰的或对照的免疫效应细胞相比，所述两种或更多种内源靶基因的功能降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。67.如权利要求65所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变或核酸抑制剂大幅抑制所述两种或更多种内源靶基因的表达。68.如权利要求65所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变或核酸抑制剂大幅抑制所述两种或更多种内源靶基因的功能。69.如权利要求50
‑
68中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变或核酸抑制剂增强所述修饰的免疫效应细胞的一种或多种效应子功能。70.如权利要求69所述的修饰的免疫效应细胞，其中与未修饰的或对照的免疫效应细胞相比，所述一种或多种效应子功能得到增强。71.如权利要求1
‑
70中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。72.如权利要求1
‑
71中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其还包含表达免疫活化分子的外源转基因。73.如权利要求1所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述免疫活化分子选自由细胞因子、趋化因子、共刺激分子、活化肽、抗体或其抗原结合片段组成的组。74.如权利要求1
‑
73中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述效应子功能选自细胞增殖、细胞存活力、肿瘤浸润、细胞毒性、抗肿瘤免疫应答和/或对耗竭的抗性。75.如权利要求1
‑
74中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其还包含展示在所述细胞表面上的工程化免疫受体。76.如权利要求75所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述工程化免疫受体是包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)。77.如权利要求76所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述工程化免疫受体是工程化T细胞受体(TCR)。78.如权利要求75
‑
77中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述工程化免疫受体能够特异性结合靶细胞表面上表达的抗原，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。79.一种组合物，其包含如权利要求1
‑
78中任一项所述的修饰的免疫效应细胞。80.如权利要求79所述的组合物，其包含至少1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x10
10
、1x10
11
或更多个修饰的免疫效应细胞。81.如权利要求79或80所述的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载剂或稀释剂。82.如权利要求79
‑
81中任一项所述的组合物，其包含自体免疫效应细胞
83.如权利要求79
‑
81中任一项所述的组合物，其包含同种异体免疫效应细胞。84.一种能够降低细胞中的选自SOCS1、PTPN2和ZC3H12A的至少两种内源靶基因的表达的基因调控系统，其包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白。85.如权利要求84所述的基因调控系统，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2。86.如权利要求84所述的基因调控系统，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A。87.如权利要求84所述的基因调控系统，其中所述至少两种内源基因是PTPN2和ZC3H12A。88.如权利要求84
‑
87中任一项所述的基因调控系统，其中所述系统包含至少两种指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。89.如权利要求88所述的基因调控系统，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2，并且其中所述系统包含至少一种靶向SOCS1的指导RNA(gRNA)分子、至少一种靶向PTPN2的gRNA分子和Cas核酸内切酶。90.如权利要求89所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列。91.如权利要求89所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列。92.如权利要求89所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含与选自SEQ ID NO:7
‑
151的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含与选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。93.如权利要求89所述的基因调控系统，其中所述所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含选自SEQ ID NO:7
‑
151的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308的核酸序列编码的靶向结构域序列。94.如权利要求89所述的基因调控系统，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A，并且其中所述系统包含至少一种靶向SOCS1的gRNA分子、至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子和Cas核酸内切酶。95.如权利要求94所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列。96.如权利要求94所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列。
97.如权利要求94所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含与选自SEQ ID NO:7
‑
151的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与选自SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。98.如权利要求94所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的gRNA分子包含选自SEQ ID NO:7
‑
151的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含选自SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575的核酸序列编码的靶向结构域序列。99.如权利要求88所述的基因调控系统，其中所述至少两种内源基因是PTPN2和ZC3H12A，其中所述系统包含至少一种靶向PTPN2的gRNA分子、至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子和Cas核酸内切酶。100.如权利要求99所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列互补的靶向结构域序列。101.如权利要求99所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的核酸序列结合的靶向结构域序列。102.如权利要求99所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含与选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含与选自SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。103.如权利要求99所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向PTPN2的gRNA分子包含选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子包含选自SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575的核酸序列编码的靶向结构域序列。104.如权利要求88
‑
103中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。105.如权利要求88
‑
103中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白，并且能够诱导双链DNA断裂。106.如权利要求88
‑
103中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体，并且能够诱导单链DNA断裂。107.如权利要求88
‑
103中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白结合。108.如权利要求107所述的基因调控系统，其中所述异源蛋白选自由MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Kr
ü
ppel相关盒(KRAB)结构域和四个串联的mSin3结构域(SID4X)组成的组。109.如权利要求84
‑
87所述的基因调控系统，其中所述系统包含至少两种核酸分子，并且其中所述至少两种核酸分子选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA。
110.如权利要求109所述的基因调控系统，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和PTPN2，并且其中所述系统包含至少一种靶向SOCS1的指导siRNA或shRNA分子和至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子。111.如权利要求110所述的基因调控系统，其中所述靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸。112.如权利要求110所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。113.如权利要求110所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA包含与选自SEQ ID NO:7
‑
151的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA包含与选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。114.如权利要求109所述的基因调控系统，其中所述至少两种靶基因是SOCS1和ZC3H12A，并且其中所述系统包含至少一种靶向SOCS1的指导siRNA或shRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子。115.如权利要求114所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸。116.如权利要求114所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子包含与表3和4中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。117.如权利要求114所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA包含与选自SEQ ID NO:7
‑
151的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA包含与选自SEQ ID NO:208
‑
230、SEQ ID NO:376
‑
812或SEQ ID NO:376
‑
575的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。118.如权利要求109所述的基因调控系统，其中所述至少两种靶基因是PTPN2和ZC3H12A，并且其中所述系统包含至少一种靶向PTPN2的指导siRNA或shRNA分子和至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子。119.如权利要求118所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列互补的约19
‑
30个核苷酸。120.如权利要求118所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子包含与表5和6中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的
约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子包含与表7和8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸。121.如权利要求118所述的基因调控系统，其中所述至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA包含与选自SEQ ID NO:185
‑
207、SEQ ID NO:272
‑
375或SEQ ID NO:272
‑
308的DNA序列编码的RNA序列结合的约19
‑
30个核苷酸，并且所述至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA包含与选自SEQ ID NO:208
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈卡，
申请(专利权)人：KSQ治疗公司，
类型：发明
国别省市：