一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种过表达miR

【技术实现步骤摘要】
一种过表达miR
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13474工程化外泌体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种过表达miR
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13474工程化外泌体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]糖尿病足部溃疡（DFU）是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，其会导致足部循环和感觉障碍，致使截肢或合并全身严重感染而死亡。目前主要通过血糖控制、减轻患肢负重、局部外敷抗生素、清创术等方法治疗，传统方法虽有一定疗效，但尚不能妥善解决溃疡创面迁延不愈等问题。因此，积极探索 DFU治疗新方案具有重要科学意义与临床转化价值。
[0003]间充质干细胞（MSC）以其可塑性和强大旁分泌能力，在再生医学领域备受关注，成为治疗组织损伤和皮肤创面的有效手段。现有研究表明MSC 主要通过旁分泌参与组织损伤修复，而外泌体（exosomes，Ex）作为 MSC 发挥旁分泌作用的重要效应成分，能选择性地装载活性蛋白和 RNA 分子等生物活性分子，广泛参与细胞存活、血管新生、免疫调节等各种生物学过程。人脐带间质干细胞源外泌体可在﹣80℃保存，避免了MSC冻存复苏的不便，融解后即可使用，使用时间易于掌握。且与干细胞自身相比，外泌体具有生物相容性好、稳定性高、免疫原性低、可被工程化改造等特点与优势，成为组织损伤“非细胞治疗（cell
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free therapy）”的新策略。
[0004]外泌体携载的miRNAs在所有小 RNA 分子中所占比例高，因富集的 miRNA 不被高温、酸碱和酶所破坏而具有较好稳定性，在基因表达调控中具有广泛而重要的作用。但目前尚无有关miR
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13474用于创面治疗领域的相关报道，更无miR
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13474高表达的外泌体用于糖尿病足创面修复治疗领域的相关报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种过表达miR
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13474工程化外泌体及其制备方法与应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞源外泌体miR
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13474，所述miR
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13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术还提供了外泌体miR
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13474在制备用于治疗促进伤口愈合的药物中的用途。
[0008]进一步地，所述的外泌体miR
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13474在制备用于治疗糖尿病足创面修复药物中的用途。
[0009]一种药物组合物，所述药物组合物中含有人脐带间充质干细胞源外泌体miR
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13474以及药学上可接受的载体或佐剂。
[0010]在本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了一种工程化外泌体，所述的工程化外泌
体中miR
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13474 过表达分泌，并通过电穿孔途径富集。
[0011]进一步地，所述的工程化外泌体为人脐带间充质干细胞源外泌体。
[0012]进一步地，所述miR
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13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]本专利技术还提供了一种工程化外泌体的制备方法，其包括以下步骤：将miR
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13474和HucMSC
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Ex充分混匀后加入到电极杯中，随后将电极杯放在电穿孔仪器的电极杯槽中进行电转，miR
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13474进入HucMSC
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Ex内得到过表达miR
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13474的工程化外泌体。
[0014]进一步地，所述电穿孔仪器的参数为：穿孔电压110 V，穿孔电压持续时间3 ms，穿孔后静息时间10 ms，驱动电压25 V，驱动电压持续时间50 ms，驱动后静息时间50 ms，驱动循环次数10。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术基于RNA测序技术，筛选差异表达miRNA分子，验证锁定关键分子miR
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13474。发现miR
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13474可增强DFL和HUVEC细胞活性、增殖能力、迁移能力，并促进HUVEC细胞成小管能力。对糖尿病足（DFU）大鼠模型创面具有明显的修复作用。本专利技术通过电穿孔技术制备miR
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13474过表达工程化外泌体，制备方法效率高，技术可推广程度高且能迅速制备大量携载不同类型外源物质的外泌体，具有极高的应用价值。本专利技术为糖尿病足治疗提供新方案，为临床转化提供支撑。
附图说明
[0016]图1是分离提取的HucMSC
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Ex和HFL1
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Ex的鉴定结果图；图2是HucMSC
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Ex中差异表达miRNA（miR
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13474）分子的筛选图；图3是qRT
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PCR验证miRNA测序结果图；图4是qRT
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PCR检测miR
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13474在多种细胞株中的表达图；图5是CCK8实验检测DFL细胞转染的细胞活性改变图；图6是细胞克隆形成实验检测DFL细胞及HUVEC细胞转染后的细胞增殖能力改变图；图7是Transwell迁移实验检测DFL细胞及HUVEC细胞转染后的细胞迁移能力改变图；图8是小管形成实验检测HUVEC细胞转染后细胞成管能力改变图；图9是miR
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13474过表达的工程化外泌体的制备流程图；图10是miR
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13474过表达工程化外泌体的荧光结果图；图11是qRT
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PCR检测的表达水平图；图12是miR
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13474过表达的外泌体对DFL细胞生物学功能的影响图；图13是miR
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13474过表达的外泌体对HUVEC细胞生物学功能的影响图；图14是DFU模型的愈合图；图15是HE切片局部对照图；图16是各组皮肤组织切片染色图。
具体实施方式
[0017]下面将结合附图和实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，下列附图和实施例仅用于说明本专利技术，而不是对本专利技术的范围的限定。除非特别指明，否则本专利技术中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0018]本专利技术基于RNA测序技术对人脐带间充质干细胞源外泌体（HucMSC
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Ex）及人胚肺成纤维细胞外泌体（HFL1
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Ex）进行 miRNA 测序分析，筛选出一种两者表达差异显著的全新miRNA分子NC_000019.10_13474（后述miR
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13474），其具有促进糖尿病足创面修复作用。考虑到外泌体具有天然的物质转运特性、相对较小的分子结构和优良的生物相容性等优势，其可作为治疗性分子的良好载体，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞源外泌体miR
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13474，其特征在于，所述miR
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13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示。2.人脐带间充质干细胞源外泌体miR
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13474、或包含所述外泌体miR
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13474的组合物在制备用于治疗促进伤口愈合的药物中的用途。3.人脐带间充质干细胞源外泌体miR
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13474、或包含所述外泌体miR
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13474的组合物在制备用于治疗糖尿病足创面修复药物中的用途。4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有人脐带间充质干细胞源外泌体miR
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13474以及药学上可接受的载体或佐剂。5.一种伤口护理产品，其特征在于，所述产品中含有人脐带间充质干细胞源外泌体miR
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13474。6.一种工程化外泌体，其特征在于，所述的工程化外泌体中miR
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【专利技术属性】
技术研发人员：史惠，王敏，张徐，钱晖，许文荣，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：