促实体瘤浸润的增强型CART细胞及其制备方法和细胞药物技术

本发明专利技术公开了一种促实体瘤浸润的增强型CART细胞及其制备方法和细胞药物，涉及CART细胞技术领域。本发明专利技术公开的CART细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列。该CART细胞对实体瘤的肿瘤组织具有更高的浸润能力，其对肿瘤细胞的杀伤能力更强，其具有广阔的临床应用前景，本发明专利技术为使用CART细胞治疗实体瘤提供了一种新的治疗思路和策略。的治疗思路和策略。的治疗思路和策略。

【技术实现步骤摘要】
促实体瘤浸润的增强型CART细胞及其制备方法和细胞药物


[0001]本专利技术涉及CART细胞
，具体而言，涉及一种促实体瘤浸润的增强型CART细胞及其制备方法和细胞药物。

技术介绍

[0002]过继性T细胞转移(Adoptive T cell transfer，ACT)是目前最有前景的免疫治疗方法，CD-19特异性的CAR-T细胞在治疗复发难治性急性淋巴细胞白血病中可出现完全缓解，其主要的治疗流程为：首先分离出患者自己的T细胞(或来自同种异体供者的T细胞)，然后予以活化并进行基因修饰以获得嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)，最后回输至患者体内。嵌合抗原受体由细胞外抗原识别结构域(通常是抗体单链可变片段scFv)与细胞内信号传导结构域(T细胞受体的CD3ζ链或同时引入一种或多种共刺激信号如CD28和4-1BB)相连接而成，其细胞外部分可使T细胞具有识别特异性抗原的能力。能够越过MHC限制性，可与其识别的抗原直接结合后便会通过信号传导结构域刺激T细胞增殖，同时激活T细胞的细胞毒作用并促进细胞因子分泌，最终消除带有该抗原的细胞，具有更好的特异性和持续性。
[0003]虽然CAR-T细胞在治疗血液瘤方面成效显著，但在治疗实体瘤上依旧面临着挑战，治疗效果并不理想。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种促实体瘤浸润的增强型CART细胞及其制备方法和细胞药物，本专利技术提供的CART细胞，其对实体瘤的肿瘤组织具有更高的浸润能力，提高了其对肿瘤细胞的杀伤能力，具有广阔的临床应用前景，为使用CART细胞治疗实体瘤提供了一种新的治疗思路和策略。
[0006]本专利技术是这样实现的：
[0007]第一方面，本专利技术实施例提供一种促实体瘤浸润的增强型CART细胞，所述CART细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列；
[0008]所述第一核酸序列含有编码嵌合抗原受体的第一编码序列，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域能够靶向所述实体瘤；
[0009]所述第二核酸序列含有编码LIGHT蛋白的第二编码序列以及位于所述第二编码序列上游的信号肽编码序列；
[0010]所述第二编码序列由组成型启动子驱动表达。
[0011]本专利技术的专利技术人分析认为，目前，CART细胞对实体瘤的治疗效果不理想的一个主要原因在于：实体瘤特殊的脉管系统和基质屏障阻止T细胞浸润。肿瘤促生的异常血管使T细胞浸润特化血管高内皮微静脉High endothelial venules(HEV)丧失功能，功能不全的HEV降低对T细胞的浸润。同时，由肿瘤相关基质细胞cancer-associated stromal cells
(CASCs)诱导形成的纤维结构影响T细胞的浸润和功能，Carcinoma-associated fibroblasts(CAFs)作为CASCs的主要子集，还可通过分泌TGF-β等细胞因子抑制T细胞功能。
[0012]LIGHT蛋白(homologous to lymphotoxins,inducible,competes With HSV glycoprotein D for HVEM,expressed by T Lymphocyte、TNFSF14)是细胞因子TNF超家族的成员，是一种诱导型炎性细胞因子。本专利技术实施例提供的CART细胞利用组成型启动子驱动LIGHT蛋白持续大量地分泌表达，即过表达LIGHT蛋白，当CART细胞接触肿瘤细胞时，这些分泌表达的LIGHT蛋白，使CART细胞对实体瘤的浸润能力得到有效提高，进而提高了CART细胞杀伤肿瘤细胞的能力，该CART细胞具有广阔的临床应用前景，本专利技术为使用CART细胞治疗实体瘤提供了一种新的治疗思路和策略。
[0013]在可选的实施方式中，所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列下游，所述组成型启动子位于所述第一核酸序列上游，所述第一编码序列和所述第二编码序列均由所述组成型启动子驱动表达。
[0014]将第一编码序列和第二编码序列置于同一组成型启动子下受其驱动表达，以及将第一核酸序列和第二核酸序列设置在一起即位于同一DNA链上，可以减少整个核酸序列的长度，降低CART细胞的基因组装载量，便于CART细胞的改造。当然，在其他的实施方式中，可以将第一编码序列和第二编码序列分别由两个独立的启动子驱动表达；甚至是将第一核酸序列和第二核酸序列分别置于不同的DNA链上或置于同一DNA链但第一核酸序列和第二核酸序列之间间隔有其他核酸序列，具有这些情形以及类似情形的CART细胞也是属于本专利技术的保护范围。
[0015]在可选的实施方式中，所述组成型启动子选自延伸生长因子-1α(EF-1α)、早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列、类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子和血红素启动子和肌酸激酶启动子中的任意一种。
[0016]但本专利技术的组成型启动子并不限于上述的启动子，使用其他类型的启动子驱动LIGHT蛋白的表达也是属于本专利技术的保护范围。
[0017]在可选的实施方式中，所述组成型启动子为EF-1α。
[0018]本专利技术的组成型启动子可以根据实际需求选择，其包括但不限于EF-1α，其只要能够驱动LIGHT蛋白大量表达即可。
[0019]这里的术语“大量表达”是指在该组成型启动子驱动下，CART细胞所分泌表达的LIGHT蛋白量高于没有该组成型启动子驱动下的表达量。
[0020]在可选的实施方式中，所述LIGHT蛋白为LIGHT全长蛋白或其功能性片段。
[0021]LIGHT蛋白可以是膜结合型、胞内游离型、胞外剪切型、或者其他各种具有活性的片段，只要其选自LIGHT全长蛋白且具有提高CART细胞杀伤肿瘤细胞的活性即可。
[0022]在可选的实施方式中，所述LIGHT蛋白为LIGHT全长蛋白的可溶性片段。
[0023]在可选的实施方式中，所述LIGHT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
[0024]缺乏胞内段和跨膜区的溶解型LIGHT(SEQ ID NO.15)依然具有正常的生物学功能，组成性表达溶解型LIGHT的癌细胞无法成瘤，并且其在IFNγ的协同作用下，LIGHT杀伤
肿瘤细胞的能力更强，更能提高CART细胞的肿瘤杀伤能力。
[0025]在可选的实施方式中，所述LIGHT蛋白融合VTP多肽。即第二编码序列编码LIGHT蛋白和VTP多肽。
[0026]在可选的实施方式中，所述VTP多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
[0027]VTP多肽可以靶向肿瘤异常血管，通过VTP多肽的融合，其可以起到靶向本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促实体瘤浸润的增强型CART细胞，其特征在于，所述CART细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列；所述第一核酸序列含有编码嵌合抗原受体的第一编码序列，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域能够靶向所述实体瘤；所述第二核酸序列含有编码LIGHT蛋白的第二编码序列以及位于所述第二编码序列上游的信号肽编码序列；所述第二编码序列由组成型启动子驱动表达。2.根据权利要求1所述的促实体瘤浸润的增强型CART细胞，其特征在于，所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列下游，所述组成型启动子位于所述第一核酸序列上游，所述第一编码序列和所述第二编码序列均由所述组成型启动子驱动表达。3.根据权利要求1或2所述的促实体瘤浸润的增强型CART细胞，其特征在于，所述组成型启动子选自EF-1α、早期巨细胞病毒启动子序列、类人猿病毒40早期启动子、小鼠乳癌病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子和血红素启动子和肌酸激酶启动子中的任意一种；优选地，所述组成型启动子为EF-1α。4.根据权利要求1或2所述的促实体瘤浸润的增强型CART细胞，其特征在于，所述LIGHT蛋白为LIGHT全长蛋白或其功能性片段；优选地，所述LIGHT蛋白为LIGHT全长蛋白的可溶性片段；优选地，所述LIGHT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。5.根据权利要求4所述的促实体瘤浸润的增强型CART细胞，其特征在于，所述LIGHT蛋白融合VTP多肽；优选地，所述VTP多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。6.根据权利要求1或2所述的促实体瘤浸润的增强型CART细胞，其特征在于，所述信号肽编码序列所编码的信号肽选自膜整合型信号肽或分泌型信号肽；优选地，所述膜整合型信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽、GM-CSF信号肽、CD4信号肽和CD137信号肽中的任意一种；优选地，所述分泌型信号肽选自IgG信号肽和细胞因子信号肽中的任意一种；优选地，所述信号肽编码序列的碱基序列如SEQ ID NO.13所示。7.根据权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娜，杜冰，刘小红，吴诗佳，席在喜，
申请(专利权)人：上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：