一种用于siRNA转染3D类器官的组合物、培养基及应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于siRNA转染3D类器官的组合物、培养基及应用。所述组合物包括：血清蛋白、卵清蛋白中的至少一种与连接蛋白、血清代替物中的至少一种复配。培养基包括：基础培养基；以下至少一种终浓度组成的促进转染细胞外基质成分：1

【技术实现步骤摘要】
一种用于siRNA转染3D类器官的组合物、培养基及应用


[0001]本专利技术涉及siRNA转染细胞
，具体涉及一种用于siRNA转染3D类器官的组合物、培养基及应用。

技术介绍

[0002]类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3D结构的细胞培养物，与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。肿瘤类器官(tumoroids)则是利用患者肿瘤组织体外培养的，与患者肿瘤的结构、生理等高度一致的“微肿瘤”。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，与诸多临床前模型如2D细胞系、PDX模型等相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力，为从基因或蛋白水平研究类器官致癌或癌症相关机制的研究提供宝贵的模型。
[0003]RNA干扰(RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的，广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA裂解成由21
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25个核苷酸组成的siRNA，随后siRNA与体内蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA随即降解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因等相关基因的过度表达，将其处于静默或休眠状态，这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。
[0004]内源性或外源性dsRNA可被体内特定的核糖核酸酶(Dicer)切割成长度为21～23个碱基对的小双链片段。这些小的双链片段称为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA是高度特异性的生物分子，能抑制或沉默其互补基因的表达。siRNA在2D细胞系的转染方法已经成功建立，而在3D类器官的应用中通常需要机械破坏已形成的类器官，将其制备成2D细胞进行转染，效率低且干扰类器官的生长状态，但是直接应用的成功率则较低。目前有研究者将目光集中在通过原位(in situ)方法将siRNA转染至类器官，但该方法一直未见有任何技术进展。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供一种用于siRNA转染3D类器官的组合物、培养基及应用。本专利技术的技术方案为：
[0006]第一个方面，本专利技术提供一种用于siRNA转染3D类器官的组合物，包括：血清蛋白、卵清蛋白中的至少一种与连接蛋白、血清代替物中的至少一种复配。
[0007]可选地，所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与血清代替物、connexin
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43复配。
[0008]可选地，所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与血清代替物、connexin
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26复配。
[0009]可选地，所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与connexin
‑
43复配。
[0010]可选地，所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与connexin
‑
26复配。
[0011]进一步地，所述组合物还包括：超电荷蛋白、磷酸钙。
[0012]第二个方面，本专利技术提供一种用于siRNA转染3D类器官的培养基，包括：基础培养基；以下至少一种终浓度组成的促进转染细胞外基质成分：1
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10％HSA(wt/v)，1
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10％BSA(wt/v)，1
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10％OVA(wt/v)；以下至少一种终浓度组成的促进转染3D类器官成分：10
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500ng/mL connexin
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43，10
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500ng/mL connexin
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26，1
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5％血清代替物。
[0013]可选地，所述基础培养基为DMEM、F12、DMEM/F12或者Opt
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MEM。
[0014]进一步地，所述培养基还包括以下终浓度的：0.1
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2μmol/L超电荷蛋白，1
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5M CaCl2，2x HBS。
[0015]第三个方面，本专利技术提供上述组合物或上述培养基在siRNA转染至3D类器官上的应用。
[0016]进一步地，所述应用的方法包括以下步骤：
[0017]步骤1：培养类器官；
[0018]步骤2：在培养获得的类器官中加入含有上述培养基的siRNA转染混合液进行siRNA转染，并于37℃、5％CO2培养3
‑
72h。
[0019]进一步地，所述含有上述培养基的siRNA转染混合液还包括：Cy
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3标记GAPDH基因的siRNA，浓度设置为10
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50nM；Lipofectamine RNAiMAX转染试剂，体积比例设置为1
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10％。
[0020]进一步地，所述siRNA转染混合液的制备方法为：分别采用上述培养基稀释Cy
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3标记GAPDH基因的siRNA与Lipofectamine RNAiMAX转染试剂，之后将两种稀释液混匀，于室温孵育10min。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术siRNA原位转染3D类器官的技术耗时少，效率高，不需要机械破坏3D类器官的形态，适用范围广，可广泛用于癌症或正常组织类器官的siRNA转染。具体优势如下：
[0022]1)转染类器官效率高，部分类器官转染6
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12小时即可达到超过95％的siRNA转染效率；
[0023]2)组分均为常见试剂，成本较低，经济实惠，促进siRNA用于3D类器官的机制研究；
[0024]3)本专利技术添加的试剂全部为水溶性抑制剂，不需要DMSO溶解，保证效果的同时减少了DMSO对体外细胞培养的毒性。
[0025]4)本专利技术为原位转染siRNA技术，填补了国内研究的空白，保留类器官的3D结构的同时，对空间构象中的基因进行siRNA转染，为了解基因功能等研究提供新的模型。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例11中类器官转染后的荧光显微镜图。
[0027]图2为本专利技术实施例12中类器官转染后的荧光显微镜图。
[0028]图3为本专利技术实施例13中类器官转染后的荧光显微镜图。
[0029]图4为本专利技术实施例14中类器官转染后的荧光显微镜图。
[0030]图5为本专利技术实施例15中类器官转染后的荧光显微镜图。
[0031]图6为本专利技术实施例16转染siRNA的类器本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于siRNA转染3D类器官的组合物，其特征在于：包括：血清蛋白、卵清蛋白中的至少一种与连接蛋白、血清代替物中的至少一种复配。2.根据权利要求1所述的一种用于siRNA转染3D类器官的组合物，其特征在于：所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与血清代替物、connexin
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43复配。3.根据权利要求1所述的一种用于siRNA转染3D类器官的组合物，其特征在于：所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与血清代替物、connexin
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26复配。4.根据权利要求1所述的一种用于siRNA转染3D类器官的组合物，其特征在于：所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与connexin
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43复配。5.根据权利要求1所述的一种用于siRNA转染3D类器官的组合物，其特征在于：所述组合物包括：HSA、BSA、OVA中的至少一种与connexin
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26复配。6.根据权利要求1所述的一种用于siRNA转染3D类器官的组合物，其特征在于：所述组合物还包括：超电荷蛋白、磷酸钙。7.一种用于siRNA转染3D类器官的培养基，其特征在于：包括：基础培养基；以下至少一种终...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰坚强，朱宇，郑斌，黄敏，
申请(专利权)人：创芯国际生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：