一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用，包括外泌体，所述外泌体内包覆有抗肿瘤的核酸药物和光敏剂，相对于天然的外泌体Nex，工程化外泌体Nex@siRNA/Ce6具有以下特性：1.靶向杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无杀伤效果。2.通过沉默PLK1基因促进肿瘤细胞凋亡；通过抑制PD

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体是涉及到一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)是由活细胞分泌的直径约为30
‑
150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构。外泌体存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中，携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息。近年来，随着外泌体研究的不断深入，其应用已经涉及肿瘤治疗、医学基础和免疫治疗等领域。NK细胞来源的外泌体保留了母细胞的免疫功能，可通过Fas/FasL途径发挥免疫作用，杀伤肿瘤细胞。在体内外显示出较好的抗肿瘤特性，但由于外泌体提取过程繁琐，产率极低，如何有效提升外泌体的疾病治疗效果是亟待解决的一个难题。
[0003]siRNA作为一种极具前景的基因靶向药物，理论上来讲可以沉默细胞中任何基因的表达，因此RNAi疗法在癌症等基因性疾病的治疗中具有巨大的潜力。但siRNA本身稳定性差，缺乏合适的递送载体限制了它的应用，如何提高siRNA的递送效率及内涵体逃逸能力是研究者们重点关注的方向。传统的基因药物主要依靠病毒作为递送载体，但是病毒载体可能会引起机体的免疫反应，具有安全性问题。此外，脂质体和聚合物也常被用做siRNA的递送载体。但是，无论是脂质体还是聚合物，都存在基因沉默效率低的问题。这是因为，载体携带siRNA进入到细胞质中后，进入到内涵体/溶酶体中，只有不到1％的siRNA可以从内涵体/溶酶体中逃逸出来进入到细胞质中发挥生物学功能，这大大限制了siRNA的应用和转化。
[0004]外泌体来源于细胞，是天然的囊泡结构，生物相容性好，是实现siRNA递送的理想载体。中国专利申请号为201780082770.7的专利申请公开了负载治疗剂的乳外泌体，其中所述治疗剂是生物治疗剂并且所述治疗剂不天然存在于乳外泌体中，所述生物治疗剂是核酸，核酸选自单链或双链DNA、iRNA、siRNA、shRNA、mRNA、非编码RNA ncRNA、反义RNA、LNA、吗啉代寡核苷酸或其类似物或缀合物，乳外泌体来源于奶牛、绵羊、山羊、骆驼、水牛、牦牛或人类乳或初乳，通过超声处理将外泌体用siRNA负载，外泌体只是作为治疗剂的媒剂，治疗剂为治疗的有效成分。
[0005]二氢卟吩类光敏剂在光动力疗法治疗恶性肿瘤中的研究进展，刘萍等，现代肿瘤医学，2020年01月，第28卷第01期，公开了二氢卟吩类光敏剂在恶性肿瘤中的应用，光敏剂通过和纳米技术结合或者其他治疗(包括热疗，化疗等)联合，治疗肿瘤。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用，本专利技术通过引入光敏剂，提高了药物的递送效率和抗肿瘤的效果。
[0007]本专利技术的内容包括一种抗肿瘤的工程化外泌体，包括外泌体，所述外泌体内包覆有抗肿瘤的核酸药物和光敏剂。
[0008]所述外泌体为免疫细胞来源的外泌体，优选为NK细胞、T细胞、B细胞或者DC细胞来源的外泌体，本申请的外泌体不能为肿瘤细胞来源的外泌体。本申请的外泌体可以是人源的外泌体，也可以是鼠源的外泌体。
[0009]所述抗肿瘤的核酸药物是长度为15
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200个核苷酸的核酸药物。优选为siRNA、micro RNA、shRNA、piRNA或ASO。siRNA更优选为靶向PLK1基因的siRNA(siPLK1)或靶向PD
‑
L1基因的siRNA(siPD
‑
L1)。
[0010]所述光敏剂为二氢卟吩类光敏剂，优选为Ce6。
[0011]一种抗肿瘤的工程化外泌体的制备方法，包括如下步骤，培养细胞，收集外泌体；然后将核酸药物装载入外泌体中，通过超滤除去游离的核酸药物，得到前工程化外泌体；将前工程化外泌体与光敏剂进行混合孵育，通过超滤除去游离的光敏剂，得到工程化外泌体。
[0012]一种所述的抗肿瘤的工程化外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果是，本专利技术提供的外泌体(Nex，Natural Killer cell
‑
derived exosomes)本身可以作为抗肿瘤药物。首先提供了Nex的制备流程与方法，随后在细胞水平上验证了Nex杀伤肿瘤细胞的能力，并验证了Nex使肿瘤细胞通过Fas/FasL途径发生凋亡。在此基础上，通过电穿孔的方式将siRNA电转进入Nex中，制备得到Nex@siRNA。随后又利用光敏剂的疏水特性将Ce6嵌入到外泌体膜上，得到工程化的外泌体Nex@siRNA/Ce6。
[0014]相对于天然的Nex，工程化外泌体Nex@siRNA/Ce6具有以下特性：
[0015]1.靶向杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无杀伤效果。
[0016]2.通过沉默PLK1基因促进肿瘤细胞凋亡；通过抑制PD
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L1的表达，激活小鼠免疫系统。
[0017]3.工程化外泌体中的光敏剂Ce6在光照下产生活性氧，在光照下产生的光动力效应促进肿瘤细胞的靶向杀伤；此外，活性氧具有破坏内涵体膜的作用，confocal共定位数据显示，实验组经过光照后siRNA与内涵体定位减少，表明其促进siRNA从内涵体逃逸到细胞质中发挥作用，提升癌细胞的基因抑制效果；活性氧还可以促进M2型巨噬细胞转向M1型巨噬细胞，激活免疫系统，协同增强抗肿瘤效果。
[0018]本专利技术结合外泌体及RNAi疗法目前的优势与缺陷，对NK细胞来源的外泌体进行改造，将siRNA装载入外泌体中，提升外泌体的抗肿瘤及免疫作用的同时，进一步提高了siRNA的递送效率。但是由于siRNA内涵体逃逸效率低的问题仍然存在，影响其在细胞中的基因沉默效果。因此，我们进一步在上述体系中引入了光敏剂，得到工程化的外泌体。当工程化外泌体进入到细胞后，在光照条件下，工程化外泌体中的光敏剂可以同时破坏外泌体膜和内涵体膜，促进siRNA释放到细胞质中发挥作用。工程化的外泌体不仅提升了siRNA的基因沉默效果，更重要的是由光敏剂诱发的光动力治疗显示出与外泌体及siRNA均非常理想的协同治疗效果。本专利技术提供的工程化外泌体协同RNAi疗法与光动力疗法，为肿瘤治疗提供了新的治疗策略与应用前景。
附图说明
[0019]图1为实施例1的纳米颗粒跟踪分析结果。
[0020]图2为实施例1的Nex的透射电镜结果(Scale bar＝100nm)。
[0021]图3为实施例2中Nex杀伤肿瘤细胞的效果，其中图3A为Nex在HepG2
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luc肿瘤细胞
上的杀伤效果，图3B为Nex在CT26肿瘤细胞上的杀伤效果。
[0022]图4为实施例2中Nex处理CT26肿瘤细胞后，细胞内凋亡相关蛋白表达情况。
[0023]图5为实施例3中Nex@siRNA/Ce6在细胞水平上的胞吞情况。
[0024]图6为实施例4中Nex@siRNA/Ce6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤的工程化外泌体，其特征是，包括外泌体，所述外泌体内包覆有抗肿瘤的核酸药物和光敏剂。2.如权利要求1所述的抗肿瘤的工程化外泌体，其特征是，所述外泌体为免疫细胞来源的外泌体。3.如权利要求2所述的抗肿瘤的工程化外泌体，其特征是，所述外泌体为NK细胞、T细胞、B细胞或者DC细胞来源的外泌体。4.如权利要求1所述的抗肿瘤的工程化外泌体，其特征是，所述抗肿瘤的核酸药物是长度为15
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200个核苷酸的核酸药物。5.如权利要求4所述的抗肿瘤的工程化外泌体，其特征是，所述抗肿瘤的核酸药物为siRNA、micro RNA、shRNA、piRNA或ASO。6.如权利要求5所述的抗肿瘤的工程化外泌体，其特征是，所述抗肿瘤的核酸药物为靶向P...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄渊余，张萌洁，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：