一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用。本发明专利技术的夹心式传感器包括分子印迹微球和核酸适配体探针，所述核酸适配体探针具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明专利技术的夹心式传感器不仅具有传统荧光探针检测的优点，且可特异性识别致敏原，该夹心式传感器将碳量子点的高灵敏的发光性能和核酸适配体高特异性识别抗原的性能相结合，从而可高效的体外检测甲壳类原肌球蛋白致敏原。而可高效的体外检测甲壳类原肌球蛋白致敏原。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用


[0001]本专利技术涉及生物分析
，具体涉及一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用。

技术介绍

[0002]甲壳类原肌球蛋白的检测方法主要有ELISA、PCR、RT
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PCR等技术，这些技术存在检测时间长、灵敏度和精确度不高(易出现假阳性)等问题。因此，原肌球蛋白的检测方式有待改进。
[0003]核酸适配体是一种对靶物质有特异性识别能力的单链的核苷酸，无毒、化学稳定性好、容易被修饰、序列设计灵活多变、无免疫原性及可以高亲和性和特异性的结合几乎任何目标分子，有望成为抗体的替代物，在生物分析领域有巨大的应用潜力和多样性的应用范围。
[0004]分子印迹聚合物作为一种识别原件，能够高特异性和选择性的识别模板分子。但相较小分子的印迹，印迹模板体积大，结构复杂且容易发生变化，印迹的难度也大。因此，对于大部分的蛋白质大分子进行印迹仍存在许多难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用。该传感器能快速、灵敏、专一的检测出甲壳类原肌球蛋白。
[0006]为此，在本专利技术的第一个方面，本专利技术提出了一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器，其包括分子印迹微球和核酸适配体探针，所述核酸适配体探针具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0007]根据本专利技术的一种夹心式传感器，其不仅具有传统荧光探针检测的优点，且可特异性识别致敏原，该夹心式传感器将碳量子点的高灵敏的发光性能和核酸适配体高特异性识别抗原的性能相结合，从而可高效的体外检测甲壳类原肌球蛋白致敏原。
[0008]可选地，所述分子印迹微球的制备包括：
[0009]将Fe3O4磁性微球和原肌球蛋白标准品溶于Tris缓冲液中，于室温振荡孵育2h后加入多巴胺，继续在室温下振荡孵育3h，清洗，溶于PBS中，再加入多肽溶液，于室温振荡孵育24h后，用SDS的乙酸溶液洗涤磁性微球，再用蒸馏水冲洗，得到分子印迹微球。
[0010]进一步地，将100mg Fe3O4磁性微球和20mg原肌球蛋白标准品溶解于20mL 10mM pH 8.0的Tris缓冲液中。
[0011]进一步地，所述多肽的氨基酸序列为EKEKEKEPPPPC。
[0012]进一步地，按照体积比为10:1加入0.71mM的所述多肽溶液。
[0013]进一步地，所述多巴胺的加入量为40mg。
[0014]进一步地，用3％(v/v)含0.1％(w/v)SDS的乙酸溶液洗涤磁铁收集的磁性微球。
[0015]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了上述夹心式传感器检测甲壳类原肌球蛋白的方法，其包括：
[0016]取2mg分子印迹微球溶于PBS缓冲液中，超声30min，确保分子印迹微球充分分散，加入待测样品溶液，置于25℃摇床中孵育2h，再加入200pmol核酸适配体探针，于25℃震荡孵育1.5h，PBS溶液清洗三次，磁分离复溶于1mL PBS溶液中，通过酶标仪测定370nm光激发下480nm处的荧光发射强度。
[0017]根据本专利技术实施例的检测方法，能快速、灵敏、专一的检测出甲壳类原肌球蛋白。
[0018]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0019]图1是分子印迹
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核酸适配体夹心式传感器的原理图；
[0020]图2是Fe3O4@PDANPs元素分析；
[0021]图3是Fe3O4@PDA NPs与印迹Fe3O4@TM
‑
PDA NPs扫描电镜图(SEM)；
[0022]图4是印迹Fe3O4@TM
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PDA静态吸附曲线；
[0023]图5是印迹Fe3O4@TM
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PDA特异性吸附图；
[0024]图6是分子印迹
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核酸适配体夹心式传感器检测的特异性。
具体实施方式
[0025]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的技术方案。应理解，本专利技术提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。
[0026]为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0027]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0028]结合图1，该夹心式传感器的原理是将分离富集元件(分子印迹微球)与信号元件(荧光适配体探针)相结合，共同构建分子印迹
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适配体夹心式生物传感器。利用分子印迹微球分离富集溶液中的原肌球蛋白，荧光适配体探针特异性识别原肌球蛋白，根据荧光信号的变化指示原肌球蛋白含量的变化。
[0029]下面参考具体实施例，对本专利技术进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本专利技术。
[0030]实施例1
[0031]原肌球蛋白的制备：
[0032](1)取50g南美白对虾肌肉，去虾头、尾、壳及肠线。
[0033](2)将虾肌肉用小刀切成泥状，溶于Buffer A(50mmol/L KCl和2mmol/L NaHCO3)中，充分均质后于4℃下抽提20min。
[0034](3)将步骤(2)抽提后的溶液于4℃、10000r/min下离心20min后取沉淀，将沉淀重悬在10倍体积的Buffer A中，4℃、10000r/min离心20min后取沉淀，重复5次。
[0035](4)将步骤(3)获得的沉淀经预冷丙酮充分洗涤至无色后用六层纱布过滤取沉淀，沉淀于室温晾干，除去脂肪及脂溶性色素等杂质得到对虾丙酮粉。
[0036](5)将对虾丙酮粉溶于Buffer B(0.02mol/L的Tris
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HCl、1mol/L的KCl和0.1mmol/L的DTT，pH 7.5)中，抽提72h。
[0037](6)将步骤(5)获得的抽提液用六层纱布过滤取滤液，滤液隔水加热20min。
[0038](7)将步骤(6)加热后的滤液于4℃、10000r/min下离心20min后，取上清液，按每100mL上清液加入16.4g硫酸铵的用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器，其特征在于，包括分子印迹微球和核酸适配体探针，所述核酸适配体探针具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的夹心式传感器，其特征在于，所述分子印迹微球的制备包括：将Fe3O4磁性微球和原肌球蛋白标准品溶于Tris缓冲液中，于室温振荡孵育2h后加入多巴胺，继续在室温下振荡孵育3h，清洗，溶于PBS中，再加入多肽溶液，于室温振荡孵育24h后，用SDS的乙酸溶液洗涤磁性微球，再用蒸馏水冲洗，得到分子印迹微球。3.如权利要求2所述的夹心式传感器，其特征在于，将100mg Fe3O4磁性微球和20mg原肌球蛋白标准品溶解于20mL 10mM pH 8.0的Tris缓冲液中。4.如权利要求2所述的夹心式传感器，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为EKEKEKEPPPPC。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞飞，余刚，傅玲琳，王彦波，李欢，李林芳，周芷卉，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：