一种从猪肝中分离的具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽、制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽、制备方法和应用。本发明专利技术的方法是（1）将猪肝经生物酶分段酶解，以便获得酶解液；(2)将所述酶解液进行超滤分离处理，以便获得混合抗氧化肽；以及(3)将所述混合抗氧化肽进行反相高效液相色谱纯化分离，以便获得目标抗氧化肽。所述抗氧化肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明专利技术提供一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽的产品，所述产品为食品或者保健品。同时提供一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽在制备治疗糖尿病和/或肥胖的药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种从猪肝中分离的具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽、制备方法和应用
本专利技术涉及一种天然食品抗氧化剂的制备方法，尤其涉及一种采用酶分段发酵法以猪肝为原料制备具有抗氧化活性和促进脂质代谢的多肽的方法以及由该方法制备得到的产品，属于蛋白制品领域。
技术介绍
氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过程，但是它却导致了自由基的形成。自1956年英国科学家Harman提出自由基理论以来，随着研究的深入，人们对自由基过量而导致的机体衰老以及对多种疾病的诱导作用有了更深的认识。活性氧自由基(ROS)被认为能引起氧化应激。而高活性的抗氧化剂的摄入是清除体内过量自由基的一个有效方法，目前生产量最大的是化学抗氧化剂，但因明显的毒副作用，导致其使用受到限制，随着人们对食品安全和抗氧化剂安全要求的提高，人们开始把目光转向天然抗氧化剂，与化学抗氧化剂相比，天然抗氧化剂的安全性要远高于前者，因而越来越受到人们的重视。蛋白质经过酶解得到多肽，使其蛋白质的结构发生改变，疏水区的活性官能基团暴露，随着肽键的裂解，小分子蛋白肽和氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原电位，使其具有清除活性自由基的能力。更重要的是，有些肽类还具有抗氧化、免疫调节、降血压、降血脂、抗菌等生理活性。猪肝具有良好的抗氧化作用，它保护生命的正常运行。前期研究证实猪肝中含有大量的维生素C和抗氧化蛋白，可以保护细胞使其免受氧自由基的伤害。体内试验研究则表明，猪肝中抗氧化蛋白能抑制铁离子催化的脂质氧化，具有保护人的低密度脂蛋白(LDL)使其免受氧化和防止红细胞的溶血作用，但是仍然缺乏更细致和深入的研究。现有的猪肝抗氧化肽的制备方法在发酵过程中，大多是直接进行单一的蛋白酶解制备，然后再将制备的多种多肽进行混合使用，然而，这样的制备方法较为复杂，不能实现将多种蛋白进行集中发酵酶解处理，节约生产成本，无法达到通过将采用微生物发酵和酶水解工艺同时进行，来降低成本的目的，不能实现通过微生物产生的端肽酶对肽末端进行修饰，使制得的肽苦味消失，而且由于微生物代谢，可产生一系列的腥味或者腥臭味，影响了猪肝抗氧化肽的感官评定指标，限制了其在商业中的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种具有抗氧化活性和促进脂质代谢的多肽。进一步的，本专利技术提供一种具有抗氧化活性和促进脂质代谢的多肽的制备方法，所述方法以猪肝为原料，通过改进酶解、分离纯化技术，制得了一种具有抗氧化活性和促进脂质代谢的多肽，具有抗氧化活性和促进脂质代谢的功能，该多肽可应用于食品领域的多个分支，如调味品、休闲食品、代餐等，更重要的是，在提高食品风味的同时，也能提高食品的营养价值和保健功能。所述制备方法包括：(1)将预处理的猪肝产品经生物酶分段酶解，以便获得酶解液；(2)将所述酶解液进行超滤分离处理，以便获得混合肽；以及(3)将所述混合肽进行反相高效液相色谱纯化分离，以便获得目标肽。其中，预处理为取猪肝（新鲜猪肝或者冷冻猪肝，但是经比较后发现新鲜猪肝的效果更好）按照猪肝：水（重量比）为1:1-3的比例加入纯净水匀浆，用纱布过滤，分离滤液和滤渣。将滤渣重悬于1倍体积的纯净水中，反复冻融3-5次后再次匀浆过滤后收集到的滤液与第一次获得的滤液混合获得猪肝过滤液。将猪肝过滤液进行微波辅助均质，微波功率300-500W、处理5-15分钟。处理后的均质液冷却到室温后调节pH至2.0~3.0，按均质液质量的0.5~2%加入胃蛋白酶在25-30℃下酶解4-6h后，调节pH至6.5-7.0，按照按均质液质量的0.5~2%加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，在45~55℃下搅拌酶解4~6h后升温至80-100℃灭酶10min。优选的，为了提高酶解效率，可以在酶解过程中辅以微波、超声、震荡等多种方式，可以根据本领域的常规手段进行优化和调整。其中超滤分离处理步骤为：将酶解灭酶后的均质液过滤后，12000-15000rpm离心10-30分钟，收集上清液。用0.45μm的滤膜抽滤，滤液再依次利用分子量截留范围为1000Da的超滤膜和200Da的纳滤膜对其进行超滤分离，收集分子量在200-1000Da的超滤组分，冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中其中反相高效液相色谱纯化分离步骤为：将前述分子量＜1000Da的超滤组分冷冻干燥后利用超纯水配置成浓度为10mg/mL，取1mL溶液上柱(1.6cm×100cm)，凝胶层析柱的填料为SephadexG-15葡聚糖凝胶树脂，用蒸馏水洗脱，收集吸收峰获得的4个洗脱组分。将收集的4个层析组分分别冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中。对获得的4个组分进行抗氧化能力的验证，选择抗氧化能力最强的组分进一步采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法进行层析，再选择其中抗氧化能力最强的组分进行成分鉴定，确定氨基酸序列。进一步的，本专利技术对获得的抗氧化肽进行生物学验证时意外地发现了这种抗氧化肽同时具有促进动物脂类代谢的功能，通过动物实验证实通过上述方法获得的多肽具有强抗氧化性和促进脂质代谢的功能。进一步的，本专利技术提出了一种分离的核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸编码前面所述的抗氧化肽。利用根据本专利技术实施例的核酸导入宿主细胞，使得宿主细胞表达前面所述的抗氧化肽。进一步的，可以将上述核酸导入宿主细胞中，在相应启动子的调控表达下，宿主细胞高效表达前面所述的抗氧化肽。进一步的，本专利技术提供一种构建体。根据本专利技术的实施例，所述构建体携带前面所述的核酸。利用根据本专利技术实施例的核酸导入宿主细胞，使得宿主细胞表达前面所述的抗氧化肽。进一步的，本专利技术提出了一种重组细胞。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞是通过前面所述的核酸或前面所述的构建体导入宿主细胞获得的。根据本专利技术实施例的重组细胞可以表达和/或分泌前面所述的抗氧化肽，可用于抗氧化肽的制备。进一步的，本专利技术提供一种抗氧化肽的应用，所述应用为食品领域或者保健品领域。进一步的，本专利技术提供一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽的产品，所述产品为食品或者保健品。进一步的，本专利技术提供一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽在制备治疗糖尿病和/或肥胖的药物中的应用。需要说明的是，制备前面所述的抗氧化肽不限于前面所述的基因工程的方法或酶解纯化猪肝的方法，本领域技术人员亦可根据实验需要，选择固相合成等化学合成等其他工艺手段获得。附图说明图1是根据本专利技术实施例的柱层析分离结果图；图2是本专利技术抗氧化肽的反相HPLC图谱；图3MTT法检测多肽对肿瘤细胞的增殖抑制作用。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1一种新鲜猪肝中抗氧化肽的制备方法取新鲜猪肝1000g，按照猪肝：水（重量比）为1:1的比例加入纯净水匀浆，用纱布过滤，分离滤液和滤渣。将滤渣重悬于1倍体积的纯净水中，于-40℃快速冷冻后置于热水中快速解冻融化，反复冻融3次后再次匀浆，利用三层无菌纱布过滤后收集到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽，其特征在于，所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1: SEWYREIR所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽，其特征在于，所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1:SEWYREIR所示。


2.一种如权利要求1所述的一种具有强抗氧化性和促进脂质代谢的多肽的制备方法，所述制备方法包括(1)将预处理的猪肝产品经生物酶分段酶解，以便获得酶解液；(2)将所述酶解液进行超滤分离处理，以便获得混合肽；以及(3)将所述混合肽进行反相高效液相色谱纯化分离，以便获得目标肽。


3.如权利要求2所述的制备方法，其中，酶解步骤为按照猪肝：水（重量比）为1:1-3的比例加入纯净水匀浆，用纱布过滤，分离滤液和滤渣。将滤渣重悬于1倍体积的纯净水中，反复冻融3-5次后再次匀浆过滤后收集到的滤液与第一次获得的滤液混合获得猪肝过滤液。将猪肝过滤液进行微波辅助均质，微波功率300-500W、处理5-15分钟;处理后的均质液冷却到室温后调节pH至2.0~3.0，按均质液质量的0.5~2%加入胃蛋白酶在25-30℃下酶解4-6h后，调节pH至6.5-7.0，按照按均质液质量的0.5~2%加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，在45~55℃下搅拌酶解4~6h后升温至80-100℃灭酶10min;
其中超滤分离处理步骤为：将酶解灭酶后的均质液过滤后，12000-15000rpm离心10-30分钟，收集上清液。用0.45μm的滤膜抽滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：史蕾，刘成阳，左常熙，逄明祝，郑大川，李海松，
申请(专利权)人：青岛新万福食品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37