一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及病毒学领域，具体涉及一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用。本发明专利技术通过优化筛选工艺，获得6条同源寡肽。本发明专利技术所提供的6条同源寡肽高亲和病毒RdRp，未来可望用作治疗RNA病毒感染的药物。本发明专利技术筛选得到的6条同源寡肽的氨基酸组成中以精氨酸(R)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)占据绝对优势，氨基酸侧链为极性亲水氨基酸，所述寡肽极易溶于水或生理溶液中，具有成药性优势。在本发明专利技术所提供的同源寡肽的两端各添加一个半胱氨酸，可形成环状，在氨基酸组成和结构上兼有跨膜肽的优势，不需要递送材料即可富集于细胞内，无毒性，成药优势突出。

【技术实现步骤摘要】
一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用
本专利技术涉及病毒学领域，具体涉及一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用。
技术介绍
病毒性疾病一直是严重危害人类公共健康的首要原因，而国内外一直存在抗病毒药短缺的状况，抗病毒药的研发落后于抗菌素等药物品种。且RNA病毒容易突变，难以预防，严重威胁人类健康，其中正链RNA病毒(+ssRNAvirus)对人类造成的威胁愈来愈烈。正链RNA病毒的基因组为一条正义RNA单链，病毒RNA链进入宿主细胞后，可以直接作为mRNA链指导蛋白质的合成。正链RNA病毒涵盖的科属众多，例如黄病毒科的登革病毒(Denguevirus，DENV)、寨卡病毒(ZIKV)。与DENV一样，冠状病毒也是有包膜的+ssRNA病毒，病毒颗粒直径为80～120nm，基因组总长在26000至32000nt之间，是已知RNA病毒中最大的病毒。寡肽或称为小分子肽，一般由4-10个氨基酸组成，远小于蛋白质分子。在人体不需消化，即可直接吸收，且不具有免疫原性，不会引起过敏或其他副作用，具有安全性的优势，是一类优质的候选药分子库。CN108395470B(《具有抑制登革病毒复制作用的短肽及其应用》)筛选出抑制登革病毒的寡肽，且获得国际优先权PCTCN2018124985。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向性好、副作用小、成药性优良的RNA病毒广谱抑制药物。抗病毒药物研发的一个巨大障碍是病毒基因的变异，往往投入巨大而以失败告终。因此选择具有保守性的分子靶标是抗病毒药物研发的关键。病毒入侵细胞是发生感染的首要步骤，但靶向病毒表面蛋白的抑制剂在研发初期可能有效，经过一个时期后，病毒表面蛋白在高突变压力下常常发生突变，所以很难开发成广谱抗病毒药物。抗病毒药物的另一个难题是，药物是否能够进入细胞内部。除逆转录病毒外，RNA病毒都编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，RdRp在RNA病毒的增殖复制中起关键作用，它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因，另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为mRNA，担负了复制酶和转录酶双重功能。基于此，第一方面，本专利技术提供具抑制RNA病毒复制作用的寡肽，所述寡肽为OP1：KHHWHRH；OP2：KHRWWHP；OP3：KHWWWHP；OP4：KHPWHHR；OP5：KHWYHHR；OP6：NWWHRSD。本专利技术以一个登革病毒株的野生序列重构表达体系，并通过优化诱导表达条件等方法，获得野生序列的DENVNS5蛋白的全长可溶性表达体系，通过优化表达条件，获得具有RdRp活性的DENVNS5重组蛋白。以DENVNS5重组蛋白为靶标，从噬菌体展示肽库中，经过多轮筛选，获得一组(6条)与RdRp具有高度亲和力的寡肽。本专利技术所述寡肽高亲和病毒的RdRp；且本专利技术筛选得到寡肽的氨基酸组成以精氨酸(R)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)占据绝对优势，所述寡肽的氨基酸侧链为极性亲水氨基酸，使得所述寡肽极易溶于水或生理溶液中，易于进入细胞，具有成药性优势。图1中绿色荧光标记的是进入细胞并在细胞内富集的寡肽。值得注意的是，本专利技术提供的6条同源寡肽与SARS-CoV-2等病毒RdRp的结合能力也很强。登革病毒粒径约40-50nm，基因组10.6kb左右，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白(NS)，登革病毒的RdRp位于其NS5C端的三分之二，其酶活性功能的正常发挥需要NS5蛋白全长的完整性。新型冠状病毒粒径80-120nm，基因组30kb，编码至少4个结构蛋白和16个非结构蛋白(nsp)。新型冠状病毒是由nsp12在nsp7和nsp8协助下执行RdRp功能。本专利技术通过分子对接实验证实本专利技术提供的6条同源寡肽与SARS-CoV-2RdRp的亲和力均高于同样靶向RdRp的对照药瑞德西韦，具有抗病毒应用潜力。第二方面，本专利技术提供了具抑制RNA病毒复制作用的特异性片段，所述特异性片段为上述寡肽的四肽、五肽、六肽片段。第三方面，本专利技术提供一种寡肽组合，含上述寡肽或上述特异性片段中的两种或多种。第四方面，本专利技术提供一种药物组合物，含有上述寡肽或上述特异性片段或上述寡肽组合。本专利技术所提供的药物组合物中的肽片段为经环化处理的环化肽。具体地，可在所述寡肽或特异性片段两端合成半胱氨酸用以寡肽或特异性片段环化，或通过七肽序列中间侧链羧基和N端氨基形成酰胺键环、侧链氨基和C端羧基形成酰胺环、七肽分子首尾酰胺成环等方式将特异性片段环化。所得到的环肽具有高效抑制病毒复制的作用，可用于正链RNA病毒感染的特异性治疗，所述正链RNA病毒为新型冠状病毒、寨卡病毒、丙肝病毒、乙脑病毒、柯萨奇病毒、西尼罗病毒、诺瓦克病毒和/或登革病毒。本专利技术筛选得到的寡肽或特异性片段表现出优良的药理活性与稳定性。因此，本专利技术还要求保护，上述的寡肽或上述特异性片段或上述寡肽组合或上述药物组合物在制备治疗RNA病毒感染药物中的应用或在抑制正链RNA病毒RdRp活性中的应用。本专利技术的有益效果至少在于：(1)本专利技术通过优化筛选工艺，得到6条具同源性的特异肽寡肽片段，所述特异性寡肽片段的氨基酸残基为4-7个氨基酸，高亲和RdRp，具广谱抗病毒作用；(2)本专利技术通过优化筛选工艺，筛选得到寡肽的氨基酸组成以精氨酸(R)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)占据绝对优势，所述寡肽的氨基酸侧链为极性亲水氨基酸，使得所述寡肽极易溶于水或生理溶液中，具有成药性优势，未来可望用作抗正链RNA病毒感染的治疗药物；(3)由于本专利技术所述寡肽序列中精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和色氨酸(W)平均占比近90％，在发挥病毒作用后可提供人体不能合成的必需或半必需氨基酸，具有支持治疗的作用，可用作各种疾病和亚健康状况的辅助治疗。附图说明图1是本专利技术所提供寡肽进入细胞并在细胞中富集的荧光显微镜图。图2是本专利技术实施例4中各细胞培养液中病毒拷贝数差异图。图3是本专利技术实施例4中光学显微镜下细胞图，空白对照是培养基中无寡肽无病毒感染的细胞，肽保护组是在病毒感染后加入寡肽的细胞，病毒对照是在病毒感染后未加寡肽的细胞。图4是本专利技术实施例7中的SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8复合体(PDBID:7BV2)晶体结构模型图。图5是本专利技术实施例7中对照药瑞德西韦与SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8复合体(7BV2)的对接图。图6是本专利技术实施例7中寡肽OP4与SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8复合体(7BV2)的对接图。图7是本专利技术实施例7中SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8复合体(7BV2)与各配体(包括本专利技术提供的6条同源寡肽和对照药瑞德西韦)对接相互作用的氨基酸位点总览图，其中不同颜色代表分子间不同的作用力。图8是本专利技术实施例7中同源寡肽OP4与丙肝病毒NS5b对接图。图9是本专利技术实施例7中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具抑制RNA病毒复制作用的同源寡肽，其特征在于，所述寡肽为KHHWHRH、KHRWWHP、KHWWWHP，KHPWHHR、KHWYHHR或NWWHRSD。/n

【技术特征摘要】
1.具抑制RNA病毒复制作用的同源寡肽，其特征在于，所述寡肽为KHHWHRH、KHRWWHP、KHWWWHP，KHPWHHR、KHWYHHR或NWWHRSD。


2.根据权利要求1所述的同源寡肽，其特征在于，所述同源寡肽高亲和登革病毒RdRp，或高亲和新型冠状病毒RdRp，或在细胞中直接可溶。


3.具抑制RNA病毒复制作用的特异性片段，其特征在于，所述特异性片段为权利要求1-2任一项所述同源寡肽的四肽片段、五肽片段或六肽片段。


4.一种寡肽组合，其特征在于，含权利要求1-2任一项所述同源寡肽或权利要求3所述特异性片段的两种或多种。


5.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述同源寡肽或权利要求3所述特异性片段或权利要求4所述寡肽组合。


6.根据权利要求5所述的药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明连，苏小进，李劲涛，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11