关于治疗实体肿瘤的工程化和非工程化γδ-T细胞的组合物和方法技术

本发明专利技术的方面包括用工程化或非工程化γδ‑T细胞治疗实体肿瘤的组合物和方法。在一些实施方案中，所述γδ‑T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)构建体。所述CAR构建体可以包含抗TryD结合结构域、CD8α铰链和跨膜结构域、共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域、其组合或全部。所述CAR构建体可以包含抗GPC3结合结构域、CD8α铰链和跨膜结构域、共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域、其组合或全部。所述CAR构建体可以包含编码分泌的共用γ链细胞因子的结构域，诸如sIL15结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】关于治疗实体肿瘤的工程化和非工程化γδ-T细胞的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年10月1日提交的美国临时专利申请号62/739,826的优先权权益，所述临时专利申请的内容特此出于任何和所有目的并入。序列表本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式通过电子方式提交并且在此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本于2020年1月8日创建，名为ADC-0006-PCT_SL.txt，大小为48,406字节。
技术介绍
从早期专注于基本淋巴因子活化和/或肿瘤浸润发展到改造这些免疫细胞以表达遗传工程化抗原受体(诸如嵌合抗原受体)的最新策略，过继细胞疗法已经经历了超过三十(30)年的不断迭代。尽管在此过程中已经有一些暗示和迹象表明了这些方法的治愈潜力，但仍有许多工作要做。特别是，CAR-T淋巴细胞能否成功根除肿瘤取决于CAR-T细胞的持久性和效应功能，但其中任何一种过量都会触发患者的移植物抗宿主效应。另外，实体组织特别存在因缺乏可用的正向刺激和存在抑制性环境而造成的问题。因此，本领域正在测试T细胞和NK细胞，特别是αβT细胞中的多种共刺激策略，以平衡功效与安全性。值得注意的是，鉴于与αβT细胞相比，目前对γδT细胞的共刺激要求缺乏了解，因此将这些各种方法中的任何一种实际转化至γδT细胞充其量是不确定的。参见例如Ribot等,“Searchingfor“signal2”:costimulationrequirementsofγδTcells”,Cell.Mol.LifeSci.(2011)68:2345-2355。因此，仍然需要改进的策略以提高细胞的特异性或选择性，以便例如通过减少或避免移植物抗宿主(GVH)作用来提高细胞的安全性，以便例如通过避免抑制效应功能来提高细胞抵抗实体肿瘤细胞的效力，并在施用于受试者后改善细胞的活性和/或存活。提供满足此类需求的方法、细胞、组合物、试剂盒和系统。
技术实现思路
本专利技术的方面包括一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含与包含肿瘤相关抗原(TAA)肽和MHC蛋白的蛋白-肽复合物特异性结合的结合结构域，其中所述复合物在实体肿瘤细胞表面上表达，任选地其中所述结合结构域以HLA限制的方式结合所述复合物；CD8α铰链结构域；CD8α跨膜结构域；共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区选自4-1BB共刺激信号传导区和CD27共刺激信号传导区；以及CD3ζ信号传导结构域。本专利技术的方面还包括本文所述的非工程化的γδT细胞以及包含编码本文所述的CAR构建体的核酸的工程化的γδT细胞，其中所述γδT细胞在γδT细胞的表面上功能性表达核酸编码的CAR。本专利技术的方面还包括本文所述的多个γδT细胞。本专利技术的方面还包括制备本文所述的γδT细胞或多个γδT细胞的方法。本专利技术的方面还包括药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂以及如本文所述的γδT细胞或多个γδT细胞。本专利技术的方面还包括使实体肿瘤细胞与肿瘤细胞杀伤有效量的如本文所述的γδT细胞或本文所述的多个γδT细胞接触。在一方面，本专利技术提供了一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含(a)与包含肿瘤相关抗原(TAA)肽和MHC蛋白的蛋白-肽复合物特异性结合的结合结构域，其中所述复合物在实体肿瘤细胞表面上表达，任选地其中所述结合结构域以HLA限制的方式结合所述复合物；(b)铰链结构域，诸如CD8α铰链结构域；(c)跨膜结构域，诸如CD8α跨膜结构域；(d)共刺激信号传导区或共刺激信号传导区的组合，任选地其中所述共刺激信号传导区选自4-1BB(CD137)共刺激信号传导区和CD27共刺激信号传导区；以及(e)信号传导结构域，诸如CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，前述元件(a)-(e)以5'至3'的顺序被编码在分离的核酸的有义链上。在一些实施方案中，所述TAA包含TyrD的连续区。在一些实施方案中，所述TyrD的连续区包含至少或至少约4个且不超过或不超过约12个TyrD连续氨基酸，优选地或优选地约7、8或9个TyrD连续氨基酸。在一些实施方案中，所述TyrD的连续区是TyrD369-377。在一些实施方案中，所述特异性结合所述TAA肽MHC复合物的结合结构域特异性结合HLA-A2/TyrD369-377。在一些实施方案中，所述结合结构域与被以下抗体结合的表位特异性结合或与以下抗体竞争，所述抗体包含：CDRH1，其包含TSGMGVS(SEQIDNO:33)；CDRH2，其包含HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQIDNO:34)；CDRH3，其包含KDYGSSFYAMHY(SEQIDNO:35)；CDRL1，其包含KASQDIHNYIA(SEQIDNO:36)；CDRL1，其包含YTSTLQP(SEQIDNO:37)；以及CDRL2，其包含LQYDNLWT(SEQIDNO:38)。在另一方面，所述结合结构域与在实体肿瘤细胞表面上表达的肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合，任选地其中所述抗原是蛋白-肽复合物，其中所述蛋白是MHC蛋白，其中所述结合结构域以HLA限制的方式结合所述蛋白-肽复合物，并且所述分离的核酸序列的编码的CAR包含(b)铰链结构域，诸如CD8α铰链结构域；(c)跨膜结构域，诸如CD8α跨膜结构域；(d)共刺激信号传导区或共刺激信号传导区的组合，任选地其中所述共刺激信号传导区选自4-1BB(CD137)共刺激信号传导区和CD27共刺激信号传导区；以及(e)信号传导结构域，诸如CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，前述元件(a)-(e)以5'至3'的顺序被编码在分离的核酸的有义链上。在一些实施方案中，所述结合结构域特异性结合在实体肿瘤细胞表面上表达的GPC3内的表位。在一些实施方案中，所述结合结构域包含以下互补决定区(CDR)，与包含以下CDR的抗体结合相同的GPC3表位，和/或与包含以下CDR的抗体竞争结合GPC3表位：CDRH1，其包含序列DYEMH(SEQIDNO:39)(或GYTFTDYEMH(SEQIDNO:40))；CDRH2，其包含序列ALDPKTGDTAYSQKFKG(SEQIDNO:41)；CDRH3，其包含序列FYSYTY(SEQIDNO:42)；CDRL1，其包含序列RSSQSLVHSNRNTYLH(SEQIDNO:43)；CDRL2，其包含序列KVSNRFS(SEQIDNO:44)；和/或CDRL3，其包含序列SQNTHVPPT(SEQIDNO:45)。在前述方面或实施方案中的任一者或本文所述的编码CAR的核酸的任一者的一些实施方案中，所述编码的CAR包含：CD8α铰链结构域，所述CD8α铰链结构域包含SEQIDNO:1(PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY)或SEQIDNO:2(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY)；或CD8α跨膜结构域，所述CD8α跨膜结构域包含SEQIDNO:3(IWAPLAGTCG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含/na.与包含肿瘤相关抗原(TAA)肽和MHC蛋白的蛋白-肽复合物特异性结合的结合结构域，其中所述复合物在实体肿瘤细胞表面上表达，任选地其中所述结合结构域以HLA限制的方式结合所述复合物；/nb.CD8α铰链结构域；/nc.CD8α跨膜结构域；/nd.共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区选自4-1BB共刺激信号传导区和CD27共刺激信号传导区；以及/ne.CD3ζ信号传导结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181001 US 62/739,8261.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含
a.与包含肿瘤相关抗原(TAA)肽和MHC蛋白的蛋白-肽复合物特异性结合的结合结构域，其中所述复合物在实体肿瘤细胞表面上表达，任选地其中所述结合结构域以HLA限制的方式结合所述复合物；
b.CD8α铰链结构域；
c.CD8α跨膜结构域；
d.共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区选自4-1BB共刺激信号传导区和CD27共刺激信号传导区；以及
e.CD3ζ信号传导结构域。


2.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述(a)-(e)呈5'至3'的顺序。


3.如权利要求1或2所述的分离的核酸序列，其中所述TAA包含TyrD的连续区。


4.如权利要求3所述的分离的核酸序列，其中所述TyrD的连续区包含至少或至少约4个且不超过或不超过约12个TyrD连续氨基酸，优选地或优选地约7、8或9个TyrD连续氨基酸。


5.如权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述TyrD的连续区是TyrD369-377。


6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸序列，其中所述特异性结合所述TAA肽MHC复合物的结合结构域特异性结合HLA-A2/TyrD369-377。


7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的核酸序列，其中所述结合结构域与被以下抗体结合的表位特异性结合或与以下抗体竞争，所述抗体包含：
a.CDRH1，其包含TSGMGVS(SEQIDNO:33)；
b.CDRH2，其包含HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQIDNO:34)；
c.CDRH3，其包含KDYGSSFYAMHY(SEQIDNO:35)；
d.CDRL1，其包含KASQDIHNYIA(SEQIDNO:36)；
e.CDRL1，其包含YTSTLQP(SEQIDNO:37)；以及
f.CDRL2，其包含LQYDNLWT(SEQIDNO:38)。


8.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含
a.与在实体肿瘤细胞表面上表达的肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合的结合结构域，任选地其中所述抗原是蛋白-肽复合物，其中所述蛋白是MHC蛋白，其中所述结合结构域以HLA限制的方式结合所述蛋白-肽复合物；
b.CD8α铰链结构域；
c.CD8α跨膜结构域；
d.共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区选自4-1BB共刺激信号传导区和CD27共刺激信号传导区；以及
e.CD3ζ信号传导结构域。


9.如权利要求8所述的分离的核酸序列，其中所述结合结构域特异性结合在实体肿瘤细胞表面上表达的GPC3内的表位。


10.如权利要求9所述的分离的核酸序列，其中所述结合结构域包含以下互补决定区(CDR)，与包含以下CDR的抗体结合相同的GPC3表位，和/或与包含以下CDR的抗体竞争结合GPC3表位：
a.CDRH1，其包含序列DYEMH(SEQIDNO:39)(或GYTFTDYEMH(SEQIDNO:40))；
b.CDRH2，其包含序列ALDPKTGDTAYSQKFKG(SEQIDNO:41)；
c.CDRH3，其包含序列FYSYTY(SEQIDNO:42)；
d.CDRL1，其包含序列RSSQSLVHSNRNTYLH(SEQIDNO:43)；
e.CDRL2，其包含序列KVSNRFS(SEQIDNO:44)；和/或
f.CDRL3，其包含序列SQNTHVPPT(SEQIDNO:45)。


11.如权利要求1至10中任一项所述的分离的核酸序列，其中所述CAR包含：
a.CD8α铰链结构域，所述CD8α铰链结构域包含SEQIDNO:1(PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY)；或SEQIDNO:2(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY)；
b.CD8α跨膜结构域，所述CD8α跨膜结构域包含SEQIDNO:3(IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC)；和/或
c.CD3ζ信号传导结构域，所述CD3ζ信号传导结构域包含：
(i)SEQIDNO:4(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)；或
(ii)SEQIDNO:5(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)。


12.如权利要求11所述的分离的核酸序列，其中所述CAR包含：
a.含有SEQIDNO:6(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)的4-1BB共刺激信号传导区；或
b.含有SEQIDNO:7(QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP)的CD27共刺激信号传导区，或者
其中所述分离的核酸编码包含SEQIDNO:6的4-1BB共刺激信号传导区以及包含SEQIDNO:7的CD27共刺激信号传导区。


13.如权利要求1至12中任一项所述的分离的核酸序列，其中所述核酸进一步编码：
a.分泌的细胞因子；或
b.分泌的共用γ链白介素；或
c.分泌的IL-15，优选地其中所述IL-15包含序列SEQIDNO:14，更优选地其中所述IL-15包含可操作地连接到分泌信号序列SEQIDNO:12的序列SEQIDNO:14，或者其中所述IL-15包含可操作地连接到分泌信号序列SEQIDNO:26的序列SEQIDNO:14；或
d.分泌的共用γ链白介素，优选地IL-15，以及白介素或白介素分泌信号的氨基末端的多顺反子接头区，优选地其中所述多顺反子接头区包含SEQIDNO:15-17、25或27-30中任一者的序列或其组合，或编码内部核糖体进入位点，例如SEQIDNO:31或32。


14.如权利要求13所述的分离的核酸序列，其中：
a.分泌信号包含序列SEQIDNO:12或SEQIDNO:26，优选地SEQIDNO:12；和/或
b.sIL15结构域包含序列SEQIDNO:14；和/或
c.P2A切割序列包含序列SEQIDNO:15或SEQIDNO:25；和/或
d.弗林蛋白酶切割序列包含序列SEQIDNO:16；和/或
e.CAR以氨基至羧基顺序包含序列SEQIDNO:17、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14。


15.如权利要求1至14中任一项所述的分离的核酸序列，其中：
a.所述结合结构域与HLA-A2/TyrD369-377特异性结合并且所述核酸编码SEQIDNO:8或SEQIDNO:18；
b.所述结合结构域与GPC3特异性结合并且所述核酸编码SEQIDNO:20或22。


16.如权利要求15所述的分离的核酸序列，其中所述核酸包含序列SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：DK萨特帕耶夫，MA赫尔曼，JM罗梅罗，YF靖，Z安，A贾克博维茨，
申请(专利权)人：阿迪塞特生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US