一种用于检测A组链球菌核酸的实时荧光定量PCR方法技术

本发明专利技术属于荧光定量PCR检测方法技术领域，具体地说，涉及一种用于检测A组链球菌核酸的实时荧光定量PCR方法。所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术实现了结果准确的A组链球菌的检测，检测下限为10拷贝/μL（50拷贝/反应），特异性好、灵敏度高、重复性好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测A组链球菌核酸的实时荧光定量PCR方法
本专利技术涉及荧光定量PCR检测方法
，具体地说，涉及一种用于检测A组链球菌核酸的实时荧光定量PCR方法。
技术介绍
A组链球菌（GroupAstreptococcus，GAS）是一类严格人类宿主的革兰阳性菌，常可引起多种感染，例如从症状较轻的咽炎到严重的侵袭性疾病如中毒性休克综合征（STSS）等，还可引起猩红热、脓疱疮、蜂窝组织炎、坏死性筋膜炎以及感染后的自身免疫反应引起的风湿热和急性肾小球肾炎等继发症。GAS可以说是目前为止能引起人类疾病种类最多的一种病原菌，也是一类最为常见的呼吸道致病菌，临床上易与肺炎支原体、呼吸道病毒等引起的咽炎相混淆。GAS感染的检测对于临床上早期诊断与预防猩红热、风湿热、急性肾小球肾炎等的发生具有重要意义。对于GAS的检测，迄今主要集中在培养法、免疫层析法和胶体金法。其中，基于生化和细菌培养的鉴定方法，灵敏度较低，且其培养周期长达24～72小时，往往错过了最佳的治疗时期。而对于免疫层析法和胶体金法，其依赖于样本中A族链球菌或其抗体的数量，难以在早期进行快速、准确地检测。相比来说，目前，较少量的研究专注于基于荧光定量PCR法的GAS检测。中国专利公开CN107058622A公开了一种多重荧光PCR法联合检测呼吸道病原体的试剂盒，其中包括GAS特异性引物和探针，但在检测GAS时的灵敏度难以令人满意。中国专利公开CN111020042A公开了检测A族链球菌的组合物及方法，包括第一引物，其序列为5’-TTAGCATTAGGTGGATTTGTTCTT-3’；第二引物，其序列为5’-GCTATCTTTTGCTTCTTTTTCGTTA-3’；和探针，其序列为5’-TAACCCAGTATTTGCCGATCAAAACTTTGC-3’。实现了结果准确的A族链球菌的检测，此外，还提供了检测A族链球菌的方法及用途。PCR检测基于引物和模板之间碱基对特异性结合，随着病毒新亚型和分离株的出现，已有实时荧光定量PCR技术可能满足不了诊断需要，需对引物和探针进行更新和优化。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测A组链球菌核酸的实时荧光定量PCR方法。该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，在于提供一种用于检测A组链球菌核酸的引物对，其中，所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术所提供的引物对可用于A组链球菌的实时荧光定量PCR检测，检测下限为10拷贝/μL（50拷贝/反应），特异性好、灵敏度高、重复性好。本专利技术的第二方面，在于提供一种用于检测A组链球菌的核酸组合，其中，所述的核酸组合包括本专利技术所述的引物对和探针。进一步地，所述的探针为TaqMan探针。在一优选实施方案中，所述TaqMan探针为经过荧光标记的探针。在另一优选实施方案中，所述TaqMan探针的5’端标记为荧光发射基团。在另一优选例中，所述TaqMan探针的荧光发射基团为FAM。在另一优选例中，所述TaqMan探针的3’端标记为荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述TaqMan探针的荧光淬灭基团为BHQ1。更进一步地，所述的TaqMan探针的序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术的第三方面，在于提供一种PCR扩增体系，其中，所述的PCR扩增体系包括用于PCR扩增的缓冲液体系和位于所述缓冲液体系中的引物对，所述的引物对为本专利技术所述的引物对。作为一种优选实施方案，扩增包括实时荧光定量PCR。在另一优选例中，所述扩增体系中上游引物或下游引物的浓度为250nM。在另一优选例中，所述扩增体系中包括TaqMan探针。在另一优选例中，所述扩增体系中TaqMan探针的浓度为150nM。本专利技术的第四方面，在于提供所述的引物对或所述的核酸组合或所述的PCR扩增体系在制备荧光定量PCR检测或辅助检测A组链球菌产品中的应用。本专利技术的第五方面，在于提供所述的引物对或所述的核酸组合或所述的PCR扩增体系在制备荧光定量PCR检测或辅助检测待测样本中是否含有A组链球菌产品中的应用。本专利技术的第六方面，在于提供一种检测A组链球菌的方法，其中，所述的方法包括如下步骤：1）使用本专利技术所述的引物对或所述的核酸组合或所述的PCR扩增体系，对检测样本进行PCR扩增反应；2）检测扩增情况，判断检测样本中A组链球菌的存在与否。本专利技术中，利用上述引物对或核酸组合或PCR扩增缓冲体系，对检测样本进行扩增反应，从而获得包含扩增产物的反应混合物，通过检测扩增情况，即可判断检测样本中是否存在A组链球菌。进一步地，步骤1）中，扩增反应时，引物对特异性结合于A组链球菌speB基因，并用于扩增对应于该基因的特异性扩增产物。本专利技术中，引物对特异性结合于A组链球菌speB基因的区域为目的基因，目的基因的序列如SEQIDNO:4所示。作为一种优选实施方案，所述的PCR扩增反应为实时定量荧光PCR扩增反应。进一步地，所述实时定量荧光PCR扩增反应参数为：95℃1min，1个循环；95℃5s，60℃15s，40个循环，在60℃延伸阶段采集荧光信号。本专利技术中，所述检测样品为核酸提取物，较佳的为DNA提取物。在另一优选例中，在步骤2）中，如果有特异性扩增产物产生，则说明检测样品中存在A组链球菌；反之则不存在。在又一优选例中，本专利技术方法是体外方法。本专利技术的实验证明，本专利技术设计能对A组链球菌进行检测，检测下限为10拷贝/μL（50拷贝/反应），特异性好、灵敏度高、重复性好。附图说明图1为特异性检测结果图。图2为GAS实时荧光定量PCR曲线图（每个浓度3个复孔）。图3为GAS实时荧光定量PCR曲线图（从每个浓度3个复孔中选取1个复孔）。图4为GAS实时荧光定量PCR标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不限于本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。文中所述的实施方法与材料仅作示范之用。Ι.实验材料和方法大肠杆菌、结核分枝杆菌菌株由天津国际生物医药联合研究院提供。实施例中使用的GASDNA片段由天津国际生物医药联合研究院委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。GAS阳性临床样本提取后的DNA由中国疾病预防控制中心提供。Ⅱ.实施例<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测A组链球菌核酸的引物对，其特征在于，所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测A组链球菌核酸的引物对，其特征在于，所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种用于检测A组链球菌的核酸组合，其特征在于，所述的核酸组合包括权利要求1所述的引物对和探针。


3.根据权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，所述的探针为TaqMan探针。


4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述的TaqMan探针的序列如SEQIDNO:3所示。


5.一种PCR扩增体系，其特征在于，所述的PCR扩增体系包括用于PCR扩增的缓冲液体系和位于所述缓冲液体系中的引物对，所述的引物对为权利要求1所述的引物对。


6.权利要求1所述的引物对或权利要求2-4任意一项所述的核酸组合或权利要求5所述的PCR扩增体系在制备荧光定量PCR检测或辅助检测A组链球菌产品中的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：常瑞恒，庞正，朱倩，刘慧芳，邵一鸣，
申请(专利权)人：天津国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：天津;12