一种自动化微生物分子检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种自动化微生物分子检测方法及其应用，属于微生物的测定或检验方法技术领域；包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均通过人机互交的形式由机械臂自动完成；试样预处理步骤能够快速核酸溶液；抽滤步骤能够实现核酸的裂解，核酸提纯步骤能够得到高纯核酸；富集步骤提高靶标核酸靶的数量，靶标基因定量检测步骤实现靶标微生物的克隆数，本发明专利技术节省了操作时间，降低了提取成本，同时保证了高效的核酸回收率有利于实现微生物分子检测全过程的自动化控制，适合在土壤检测、植物检测、食品检测中应用。

【技术实现步骤摘要】
一种自动化微生物分子检测方法及其应用
本专利技术提供一种自动化微生物分子检测方法及其应用，属于微生物的测定或检验方法

技术介绍
微生物分子检测技术是基于微生物特异靶标分子进行的一种微生物检测技术。微生物，特别是有害微生物，在进行正常新陈代谢的同时，会合成一些独特的、能够表征自身特征的化合物，如黄曲霉毒素等。这些化合物的合成途径具有特异性，其中一些关键控制基因往往是独一无二的，其基因拷贝数能够直接反映微生物个体的数量，因此，利用微生物中特异的靶标基因进行微生物定量检测已成为国内外公认的有效方法之一。荧光定量PCR法通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。利用其对各种食品中各类微生物的检测已获得我国各级政府和各类食品检测机构的认可，如2007年国家质量监督检验检疫总局发布的食品中致病菌检测方法-实时PCR法(SN/T1870-2007)等。虽然国内外研究人员在微生物靶标基因研究已获得重大成果，已完成了沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶澡弧菌等致病菌的靶标微生物筛选和检测方法的建立。但迄今为止，基于荧光定量PCR法的微生物分子检测并未在全国各检验检测机构获得广泛应用，主要原因如下：1.检测流程复杂：对特定样本进行微生物分子检测，其流程主要包括样本处理、核酸提纯和靶基因定量检测。以固态食品为例，样本处理主要目标是将微生物富集和微生物细胞裂解；核酸提纯包括核酸结合、核酸盐洗、核酸洗脱等步骤；靶基因定量手工操作主要是荧光定量PCR体系配制，由于体系成分复杂，体系配制工作量较大。以上操作包括各种试剂的移加、加热、振摇、离心等，步骤多达50步以上，每个研究人员每天工作8小时，最多只能完成12个样品操作。2.操作难度大：由于检测流程复杂，每一步骤的遗漏均会使得检测结果无效，且由于分子检测移液微量，精准度要求高，这加大了一线检测人员的操作难度。此外，手工操作往往存在人为误差，难以实现结果一致性，往往造成同样标准方法，不同检测人员做出的结果不同，使得操作人员在上岗前需进行大量的培训，大大增加检测结构的人力成本。3.分析成本高：现今分子检测试剂大多来源于美国等国外试剂公司，每个样品分析试剂成本均在100元以上。国内一些分子检测试剂产家，其产品价格虽然低一些，但由于在实际使用中的复杂性，且现今还没有统一的质量标准，很难被市场所接受。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种自动化微生物分子检测方法及其应用，实现试样预处理、核酸提纯、检测整个过程的全程自动化和准确性。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是:一种自动化微生物分子检测方法及其应用，包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均通过人机互交的形式由机械臂自动完成；试样预处理步骤包括：在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；所得混合溶液中加入结合缓冲液和CarrierRNA；所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液；所述抽滤步骤为：取一块多孔板；在多孔板外罩上围护结构；在围护结构顶部盖上过滤多孔板使围护结构组成密闭空间，过滤多孔板的反应孔内设置有滤膜和连通反应孔内外空间的通道；将围护结构组成密闭空间抽真空使其形成负压，过滤多孔板内的放入核酸裂解液，核酸裂解液透过滤膜滴入位于其下方的多孔板；核酸提纯步骤包括：在核酸初提液中加入高盐溶液和可与核酸特异结合的磁性粒子，振摇后施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；加入盐洗液，振摇洗脱去除磁性粒子结合的盐粒子，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；加入乙醇，振摇洗脱去除磁性粒子结合的其它杂质，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体，并室温干燥；加入核酸洗脱液，振摇洗脱吸附在磁性粒子上的核酸，施加磁场吸附磁性粒子，移取全部液体得到高纯核酸；靶标基因定量检测步骤包括：在高纯核酸中加入靶标基因PCR扩增上下游引物、PCR扩增体系试剂、检测探针，依次进行解链、退火、延伸进行靶基因的PCR扩增；在每次延伸结束时进行荧光检测，通过荧光值计算靶标基因拷贝数，继而计算出待分析试样中靶标微生物的克隆数。所述生物样本包括土壤水溶液、植物水溶液和食品水溶液。所述结合缓冲液主要包括1-8M盐酸胍、10-200mMTris-HCl、10-100mMEDTA、100-800mMNaCl、0.5％-2％SDS,所述结合缓冲液中Tris-HCl的pH值为6.0-7.0。所述洗脱缓冲液主要包括10-100mMTris-HCl、1-10mMEDTA；所述Tris-HCl的pH值为7.0-8.5。所述核酸裂解液包括CuHCl、NaOH、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、NaCl、聚乙二醇辛基苯基醚、表面活性剂、苯酚、异戊醇，所述试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤均在多孔板内进行。所述高盐溶液为6M盐酸胍,所述的盐洗液为6M盐酸胍加等体积乙醇组成的混合液，所述的核酸洗脱液为10mMTris-HCL。所述靶标基因定量检测之间设置有富集步骤，所述富集步骤为：在多孔板的反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样进行磁性粒子吸附操作，之后去除液体；将其他反应孔内的核酸粗提液或高纯核酸试样定量地移入反应孔内，进行磁性粒子吸附操作后去除液体；重复上述操作，直至磁性粒子吸附的靶标核酸达到可分析的量为止。所述PCR扩增体系试剂采用如下方式制备：将PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、反应特异性引物、探针与冻干保护剂溶液按照预定比例混合后，冷冻干燥；所述冷冻干燥分为预冷冻、主要冷冻干燥、加强干燥三个阶段，第一阶段为预冷冻，缓慢降温至-35至-40摄氏度，降温时长大于1小时，并在该温度条件下保持2.5小时；第二阶段为主要冷冻干燥阶段，温度保持-15至-20摄氏度，保持5小时，其中气压保持在0.1mbar；第三阶段为加强干燥，温度保持15-25摄氏度，干燥时间2小时，气压保持0.1mbar，所述PCR扩增体系试剂采用的冻干保护剂包括：甘露醇、聚乙二醇、麦芽糖、抗坏血酸以及聚乙烯吡咯烷酮。其检测方法在土壤检测、植物检测、食品检测中的应用。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：玻纤滤纸直接吸附纯化核酸，该提取方法提取操作快速方便，所需样本量小,本专利技术采用人与机械的结合，利用机械臂替代人手完成试样预处理、核酸提纯和靶基因荧光检测操作步骤，并按需自动调取设备中已有数据库中靶基因检测程序和定量标准曲线；最后自动计算获得待分析样品中靶标微生物的克隆数，而且检测前无需增菌处理，检测过程无人为误差，可基本防止假阴性和假阳性，准确性更高，更加快速。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术的技术方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自动化微生物分子检测方法，其特征在于：包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均通过人机互交的形式由机械臂自动完成；/n试样预处理步骤包括：(1)在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；(2)所得混合溶液中加入结合缓冲液和CarrierRNA；(3)所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；(4)用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；(5)在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液；/n抽滤步骤为：(1)取一块多孔板；(2)在多孔板外罩上围护结构；(3)在围护结构顶部盖上过滤多孔板使围护结构组成密闭空间，过滤多孔板的反应孔内设置有滤膜和连通反应孔内外空间的通道；(4)将围护结构组成密闭空间抽真空使其形成负压，过滤多孔板内的放入核酸裂解液，核酸裂解液透过滤膜滴入位于其下方的多孔板；/n核酸提纯步骤包括：(1)在核酸初提液中加入高盐溶液和可与核酸特异结合的磁性粒子，振摇后施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(2)加入盐洗液，振摇洗脱去除磁性粒子结合的盐粒子，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(3)加入乙醇，振摇洗脱去除磁性粒子结合的其它杂质，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体，并室温干燥；(4)加入核酸洗脱液，振摇洗脱吸附在磁性粒子上的核酸，施加磁场吸附磁性粒子，移取全部液体得到高纯核酸；/n靶标基因定量检测步骤包括：(1)在高纯核酸中加入靶标基因PCR扩增上下游引物、PCR扩增体系试剂、检测探针，依次进行解链、退火、延伸进行靶基因的PCR扩增；(2)在每次延伸结束时进行荧光检测，通过荧光值计算靶标基因拷贝数，继而计算出待分析试样中靶标微生物的克隆数。/n...

【技术特征摘要】
1.一种自动化微生物分子检测方法，其特征在于：包括试样预处理步骤、核酸提纯步骤、靶标基因定量检测步骤，上述步骤均通过人机互交的形式由机械臂自动完成；
试样预处理步骤包括：(1)在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；(2)所得混合溶液中加入结合缓冲液和CarrierRNA；(3)所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；(4)用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；(5)在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液；
抽滤步骤为：(1)取一块多孔板；(2)在多孔板外罩上围护结构；(3)在围护结构顶部盖上过滤多孔板使围护结构组成密闭空间，过滤多孔板的反应孔内设置有滤膜和连通反应孔内外空间的通道；(4)将围护结构组成密闭空间抽真空使其形成负压，过滤多孔板内的放入核酸裂解液，核酸裂解液透过滤膜滴入位于其下方的多孔板；
核酸提纯步骤包括：(1)在核酸初提液中加入高盐溶液和可与核酸特异结合的磁性粒子，振摇后施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(2)加入盐洗液，振摇洗脱去除磁性粒子结合的盐粒子，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体；(3)加入乙醇，振摇洗脱去除磁性粒子结合的其它杂质，施加磁场吸附磁性粒子，移除全部液体，并室温干燥；(4)加入核酸洗脱液，振摇洗脱吸附在磁性粒子上的核酸，施加磁场吸附磁性粒子，移取全部液体得到高纯核酸；
靶标基因定量检测步骤包括：(1)在高纯核酸中加入靶标基因PCR扩增上下游引物、PCR扩增体系试剂、检测探针，依次进行解链、退火、延伸进行靶基因的PCR扩增；(2)在每次延伸结束时进行荧光检测，通过荧光值计算靶标基因拷贝数，继而计算出待分析试样中靶标微生物的克隆数。


2.根据权利要求1所述的一种自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述生物样本包括土壤水溶液、植物水溶液和食品水溶液。


3.根据权利要求1所述的一种自动化微生物分子检测方法，其特征在于：所述结合缓冲液主要包括1-8M盐酸胍、10-200mMTris-HCl、10-100mMEDTA、100-800mMNaCl、0.5％-2％SDS,所述结合缓冲液中Tris-HCl的pH值为...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭长城，杨坤，王亚萍，
申请(专利权)人：黄河水利委员会黄河中心医院，
类型：发明
国别省市：河南;41