一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，包括PCR预混液、PCR酶、标准品及引物干板，所述标准品是以cDNA G1、cDNA G2、cDNA G3、cDNA G4中的两种或四种cDNA的混合物；试剂盒检测的靶标为miRNA，靶标miRNA包含至少一种高GC占比miRNA和至少一种低GC占比miRNA。本发明专利技术能全面准确评估设备的真实性能，可以观测出设备的边际效应情况，对于研究者需要进行精准研究时，可以根据试剂盒的校准情况，有效避开明显影响的边际范围。

【技术实现步骤摘要】
一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒。
技术介绍
随着基因领域研究的推进，基因检测技术也获得了快速发展，实时荧光定量PCR仪的应用也越来越广泛。实时荧光定量PCR检测技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，实时荧光定量PCR仪整合的元件非常多，系统复杂，体积也较大，设备的校准一直是一个较为困难的问题。为保持其检测的精度，设备每年又需要按时进行校准。目前实时荧光定量PCR的校准一般是请厂家或者专业的第三方机构进行校准，自己往往没有想要的设备及校准能力，所以校准费用往往比较高，而且校准的方式也是比较粗放的，不能精确反应设备的实际状况，比如设备都有的边缘效应，但没有校准方式能体现边缘效应大概有多大，大概什么范围内的反应是相对稳定的，因此，提供一种低成本简易并且精确的校准方式就显得非常重要。目前针对荧光定量PCR仪的校准主要有两种方式：一种是对荧光定量PCR仪的温场部分进行校准，这种方法无法对荧光定量PCR仪的光学部分进行校准，不能对设备性能进行全面的评估；另外一种是利用化学试剂对设备进行检测，一般是使用生物试剂测试盘或采用已知浓度的质粒DNA，这种方法比较粗放，不能很精确的反应设备性能，不能体现出设备的边缘效应，孔间温差的微小差别可能在基因扩增的过程中被指数级放大，对于较精细的实验可能会影响实验结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决实时荧光定量PCR仪精确校准问题，提供一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，能全面准确评估设备的真实性能，可以观测出设备的边际效应情况，对于研究者需要进行精准研究时，可以根据试剂盒的校准情况，有效避开明显影响的边际范围。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，包括PCR预混液、PCR酶、标准品及引物干板，所述标准品是以cDNAG1、cDNAG2、cDNAG3、cDNAG4中的两种或四种cDNA的混合物，cDNAG1的序列见SEQIDNo.1所示，cDNAG2的序列见SEQIDNo.2所示，cDNAG3的序列见SEQIDNo.3所示，cDNAG4的序列见SEQIDNo.4所示；试剂盒检测的靶标为miRNA，靶标miRNA包含至少一种高GC占比miRNA和至少一种低GC占比miRNA。所述靶标miRNA包括miRNAG1、miRNAG2、miRNAG3和miRNAG4，其中miRNAG1和miRNAG4的GC占比为20％-40％(低GC占比)，miRNAG2和miRNAG3的GC占比为60％-80％(高GC占比)。miRNAG1的序列见SEQIDNo.5所示，miRNAG2的序列见SEQIDNo.6所示，miRNAG3的序列见SEQIDNo.7所示，miRNAG4的序列见SEQIDNo.8所示。cDNAG1是以miRNAG1为模板逆转录而得或根据序列直接合成；cDNAG2是以miRNAG2为模板逆转录而得或根据序列直接合成；cDNAG3是以miRNAG3为模板逆转录而得或根据序列直接合成；cDNAG4是以miRNAG4为模板逆转录而得或根据序列直接合成。所述PCR酶为DNA聚合酶，浓度为2U/ul-10U/ul。所述引物干板为384孔板或96孔板，引物干板上含检测靶标miRNA的正反引物干粉。检测靶标miRNA的引物包括用于检测miRNAG1的引物：正向引物：5’-GGCATAGGTTATGGCTTTTCA-3’，反向引物：5’-ACCGCTGGTCACATAGGAATG-3’。检测靶标miRNA的引物包括用于检测miRNAG2的引物：正向引物：5’-TCATCACTTGAGCGCCT-3’，反向引物：5’-CTGTCACCTCGGCTCTGTC-3’。检测靶标miRNA的引物包括用于检测miRNAG3的引物：正向引物：5’-ACCGCACAAAGCCTGCCC-3’，反向引物：5’-GCCTGGACCCGAGGAGC-3’。检测靶标miRNA的引物包括用于检测miRNAG4的引物：正向引物：5’-ATCCACCCTCCGTCAAGAGCAA-3’，反向引物：5’-CAGGCGCGTCACATTTTTCGTT-3’。本专利技术的有益效果是：1、操作简单，将对应靶标引物提前冻干或烘干到反应板上，使用时，简单配制好混合液后直接加入至反应板中即可。2、检测靶标的GC占比不同，能反应测试不同基因时的情况。3、反应灵敏，检测的靶标为miRNA，能将设备的边缘效应在实验结果上体现出来，做精细实验时，可以避开明显差别区域。4、做一次校准，数据不同的分析方式可以体现设备不同方面的性能，可以对设备进行全面的评估。5、序列短，能缩减合成靶标以及引物的支出，成本较低。附图说明图1是384孔板引物分布图。图2是96孔板引物分布图。图3是边际效应热图。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例：试剂盒的组成包括：序号组分规格数量1PCR预混液3749ul/管2管2PCR酶120ul/管1管3标准品280ul/管2管4引物干板1板/包2包所述PCR酶为DNA聚合酶，浓度为2U/ul-10U/ul。其中标准品为2种或4种miRNA逆转录后的cDNA混合溶液，cDNA也可根据序列直接合成；其中选用靶标miRNA的GC含量不同，G1/G4的GC占比为20％-40％，G2/G3的GC占比为60％-80％；浓度为102copies/ul-106copies/ul。其中引物干板为384孔板或96孔板，板上含检测靶标的正反引物干粉，工艺为烘干或冻干。具体实施例1：384实时荧光定量PCR仪校准试剂盒生产生产步骤如下：1、PCR酶生产：本实施例中选用的DNA聚合酶品牌为：LGC；货物名称：KlearTaq-5000U；2、将DNA聚合酶按5U/ul的浓度进行稀释，按120ul/管进行分装，分装后贴标；3、PCR预混液生产：本实施例中选用的PCRBuffer品牌为：MiRXES；货物名称：PCRBufferPremix(10X)。将10×预混液使用无酶无核酸水稀释至2×浓度，混匀后按3749ul/管进行分装，分装后贴标；4、标准品生产：本实施例中G1/G2/G3/G4的cDNA为直接合成，按厂家提供的浓度报告配制成等浓度溶液后等比例进行混合，混合后稀释至6*104copies/ul，按280ul/管进行分装，分装后贴标；其中cDNA序列见表1：表1：cDNA序列表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，其特征在于，包括PCR预混液、PCR酶、标准品及引物干板，所述标准品是以cDNA G1、cDNA G2、cDNA G3、cDNA G4中的两种或四种cDNA的混合物，cDNA G1的序列见SEQ ID No.1所示，cDNA G2的序列见SEQ ID No.2所示，cDNA G3的序列见SEQ ID No.3所示，cDNA G4的序列见SEQ ID No.4所示；试剂盒检测的靶标为miRNA，靶标miRNA包含至少一种高GC占比miRNA和至少一种低GC占比miRNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，其特征在于，包括PCR预混液、PCR酶、标准品及引物干板，所述标准品是以cDNAG1、cDNAG2、cDNAG3、cDNAG4中的两种或四种cDNA的混合物，cDNAG1的序列见SEQIDNo.1所示，cDNAG2的序列见SEQIDNo.2所示，cDNAG3的序列见SEQIDNo.3所示，cDNAG4的序列见SEQIDNo.4所示；试剂盒检测的靶标为miRNA，靶标miRNA包含至少一种高GC占比miRNA和至少一种低GC占比miRNA。


2.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，其特征在于，所述靶标miRNA包括miRNAG1、miRNAG2、miRNAG3和miRNAG4，其中miRNAG1和miRNAG4的GC占比为20％-40％，miRNAG2和miRNAG3的GC占比为60％-80％。


3.根据权利要求2所述的一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，其特征在于，miRNAG1的序列见SEQIDNo.5所示，miRNAG2的序列见SEQIDNo.6所示，miRNAG3的序列见SEQIDNo.7所示，miRNAG4的序列见SEQIDNo.8所示。


4.根据权利要求1或2所述的一种实时荧光定量PCR仪校准试剂盒，其特征在于，cDNAG1是以miRNAG1为模板逆转录而得或根据序列直接合成；cDNAG2是以miRNAG2为模板逆转录而得或根据序列直接合成；cDNAG3是以miRNAG3为模板逆转录而得或根据序列直接合成；cDNAG4是以miRNAG4为模板逆转录而得或根据序列直接合成。


5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡腾杰，何玉红，周秋梅，
申请(专利权)人：杭州觅因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33