一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，所述试剂盒的组成至少包括RT反应液、PCR反应液、RT酶、PCR酶、参考品、空白对照及引物板；所述参考品为2‑4次冻融处理后microRNA稳定表达的混合人血清。本发明专利技术通过荧光定量RT‑PCR技术对多种microRNA进行同时检测，通过对试剂盒的优化，降低了检测难度，尤其适合多靶标高通量的快速检测；通过参考品的建立，将因原材料变更、操作差异、设备等因素造成的波动进行了消除，降低了检测壁垒，不会因操作差异导致检测结果的异常，促进依托于microRNA检测的试剂盒市场化的发展。

【技术实现步骤摘要】
一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒。
技术介绍
microRNA是一类长约19-25个核苷酸的单链非编码RNA分子，这些microRNA通常靶向一个或多个mRNA，通过抑制靶基因的翻译过程对基因表达进行调节。现有研究表明，常见的癌症存在相关的microRNA表达改变，而且microRNA通常定位于与癌症相关的基因组区域，因此可推测microRNA可能发挥着抑癌基因和癌基因的双重作用(Esquela-Kerscher,A.andSlack,F.J(2006)NatRevCancer6,259-269；Calin,G.A.andCroce,C.M.(2007)JClinInvest117,2059-2066；Blenkiron,C.andMiska,E.A.(2007)HumMolGenet16,R106-R113)。成熟的microRNA会与其他蛋白质一起组成miRNA-蛋白质复合体，因此它们在体外非常稳定(Lu,J.etal.,(2005)Nature435,834-838；Lim,L.P.etal.,(2005)Nature433,769-773)，在作为肿瘤生物标志物方面比mRNA具有更大的优势，已证实的microRNA在癌症中的异常表达更突出了它们作为诊断和预后生物标志物的潜在应用价值。microRNA在不同样本中表达水平差异很大，而且序列很短且序列同源，给发展超灵敏度的检测方法带来了挑战。目前使用较多的检测方法是Northernblot以及在此基础上衍生出来的一些方法，这类方法检测过程冗长，技术相对复杂，对检测人员专业程度要求相对较高，且特异性水平不太稳定，所以限制了其应用。而且提取出来的microRNA没有了蛋白质的保护，容易受外界因素的影响，诸如操作人员、设备、实验时长、反应体系都会对检测结果造成影响，导致在普通实验室不易开展，同一样品不同对象操作检测结果差异较大，严重影响检测的精确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，通过荧光定量RT-PCR技术对多种microRNA进行同时检测，通过对试剂盒的优化，降低了检测难度，尤其适合多靶标高通量的快速检测；通过参考品的建立，将因原材料变更、操作差异、设备等因素造成的波动进行了消除，降低了检测壁垒，不会因操作差异导致检测结果的异常，促进依托于microRNA检测的试剂盒市场化的发展。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，所述试剂盒的组成至少包括RT反应液、PCR反应液、RT酶、PCR酶、参考品、空白对照及引物板；所述参考品为2-4次冻融处理后microRNA稳定表达的混合人血清。所述冻融处理的冷冻温度为-15℃至-80℃。所述RT反应液包含：RT预混液5×20％-45％，浓度30-150nM的特异性RT引物，浓度1-4mM的dNTP，浓度5-20mM的MgCL2，其余为无核酸酶水。所述PCR反应液包含：PCR预混液10×20％，浓度2-8mM的MgCL2，其余为无核酸酶水。所述RT酶为逆转录酶；所述PCR酶为DNA聚合酶。所述空白对照为无核酸酶水。所述引物板为384孔板或96孔板，引物板上具有检测靶标的正反引物干粉。microRNA因其序列短且同源，导致其不稳定且检测困难，而且特异性也较差，对检测人员专业程度要求较高，在普通实验室不易开展检测工作，检测壁垒限制了其产业化的推进。另外microRNA检测容易受诸多因素影响，原材料的改变、人员操作差异、设备等都会造成检测结果的波动，对开发产品的稳定性也会造成影响。如果需同时检测多种microRNA靶标，检测过程将更复杂，操作时间更长，microRNA的不稳定特性会更加明显，给准确检测增加更多变数。本专利技术在试剂盒中使用microRNA稳定表达的混合人血清作为参考品，在检测样本中含有的microRNA时，会因原材料变更、操作差异、设备等因素造成检测结果波动，但样本的波动跟参考品的波动是一致的，根据参考品的波动可以将样本进行校准，减小样本的检测偏差。参考品的引入，将因人员操作差异，原材料变更，设备等因素造成的检测偏差进行校准，保证检测结果相对准确。引物板使用，操作简易，减少操作时间，降低检测偏差。单个反应体系中多靶标同步进行逆转录反应，操作简易，较强特异性。作为具体的一种应用方式，本专利技术提出了一种具有校准功能的胃癌检测用microRNA检测试剂盒，所述试剂盒的组成包括RT反应液、PCR反应液、RT酶、PCR酶、参考品、阳性质控品、阴性质控品、空白对照及引物板；所述RT反应液包含：RT预混液5×20％-45％，浓度30-150nM的12个靶标特异性RT引物，浓度1-4mM的dNTP，浓度5-20mM的MgCL2，其余为无核酸酶水；所述PCR反应液包含：PCR预混液10×20％，浓度2-8mM的MgCL2，其余为无核酸酶水；所述RT酶为逆转录酶，浓度为100U/ul-300U/ul；所述PCR酶为DNA聚合酶，浓度为2U/ul-10U/ul；所述空白对照为无核酸酶水；所述参考品为2-4次冻融处理后microRNA稳定表达的混合人血清；所述靶标包括hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-183-5p及hsa-miR-340-5p。所述阳性质控品为含12种靶标microRNA的混合RNA溶液；所述阴性质控品为不含12种靶标microRNA的混合RNA溶液；所述引物板为384孔板，引物板上含检测靶标的正反引物干粉。本专利技术的有益效果是：(1)试剂盒的RT反应液中RT引物设计采用专利《修饰的茎-环寡核苷酸介导的反转录和碱基间隔限制的定量PCR》(专利号CN201180038333.8)的方法，增强其特异性，使其能满足样本在单个反应体系中进行多靶标的逆转录反应，在进行多个靶标检测时，只需配制一个反应体系，即可完成全部靶标的逆转录，简化了多靶标检测的操作流程。(2)试剂盒中使用microRNA稳定表达的混合人血清作为参考品，在检测样本中含有的microRNA时，会因原材料变更、操作差异、设备等因素造成检测结果波动，但样本的波动跟参考品的波动是一致的，根据参考品的波动可以将样本进行校准，减小样本的检测偏差。(3)试剂盒中引物板上含有靶标PCR正反引物干粉，对于多靶标检测来说，每个样本都需要配制不同的反应体系，再加至反应板中进行PCR反应，需要较长操作时间，而且不同的配制会加大检测误差。使用引物板后，只需配本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成至少包括RT反应液、PCR反应液、RT酶、PCR酶、参考品、空白对照及引物板；所述参考品为2-4次冻融处理后microRNA稳定表达的混合人血清。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成至少包括RT反应液、PCR反应液、RT酶、PCR酶、参考品、空白对照及引物板；所述参考品为2-4次冻融处理后microRNA稳定表达的混合人血清。


2.根据权利要求1所述的一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述冻融处理的冷冻温度为-15至-80℃。


3.根据权利要求1所述的一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述RT反应液包含：RT预混液5×20％-45％，浓度30-150nM的特异性RT引物，浓度1-4mM的dNTP，浓度5-20mM的MgCL2，其余为无核酸酶水。


4.根据权利要求1所述的一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包含：PCR预混液10×20％，浓度2-8mM的MgCL2，其余为无核酸酶水。


5.根据权利要求1所述的一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述RT酶为逆转录酶；所述PCR酶为DNA聚合酶。


6.根据权利要求1所述的一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述空白对照为无核酸酶水。


7.根据权利要求1所述的一种具有校准功能的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述引物板为384孔板或96孔板，引物板上具有检测靶标的正反引物干粉。


8.一种具有校准功能的胃癌检测用microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡腾杰，周秋梅，程丹丹，
申请(专利权)人：杭州觅因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33