分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法技术

本发明专利技术公开一种分散液液微萃取‑高效液相色谱‑串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：S1、称取待测烟末，加入甲醇水溶液超声提取；S2、取上清液加C18吸附剂涡旋，离心取上层清液，加入萃取剂混合均匀，迅速注入水中超声振荡得到乳浊液；S3、将乳浊液离心分层，取下层有机溶液氮气吹干；S4、将固形物用甲醇‑水溶液复溶制成待测液；S5、配制黄曲霉毒素的基质配标系列标准工作溶液，采用HPLC‑MS/MS同时检测黄曲霉毒素，建立标准曲线；S6、将待测液置于色谱瓶内，采用HPLC‑MS/MS进行定量分析。本方法的样品前处理简单，结果准确，灵敏度高，适合于烟叶中多种黄曲霉毒素同时检测。

【技术实现步骤摘要】
分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法
本专利技术属于真菌毒素检测
，特别是分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法。
技术介绍
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌基于自身生理机制在适宜环境下产生的有毒次级代谢物，其作用是帮助真菌自我防御或有效寄生。人若摄入被黄曲霉毒素污染的食品，则可能造成食物中毒或诱发各种急、慢性疾病等。目前已知的黄曲霉毒素有十多种，其中以B1、B2、G1和G2最为常见，其中以黄曲霉毒素B1(简称AFB1，其余类推)的毒性最强。在世界范围内，黄曲菌毒素对农作物、食品存在着广泛的污染，其来源可能为作物生长过程中真菌感染形成的毒素残留或食品霉变过程中产生的毒素。烟叶的生产和贮藏过程中，也面临着被毒素污染的威胁。目前，黄曲霉毒素的富集和纯化多采用免疫吸附柱和多功能净化柱(如MycoSep萃取柱)等。这类固相萃取柱子选择性强、效率高，但是价格昂贵。分散液液微萃取(Dispersiveliquid-liquidmicroextraction，DLLME)技术是2006年以来发展的一种新的分离富集技术，它通过在萃取过程中形成三元乳浊液体系，有效提升萃取效率，具有便捷、高效、有机溶剂用量少等特点。用于黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等，其中高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)由于其固有的高灵敏度和高特异性，能同时定量分析复杂基质中的多个目标化合物，正逐渐显示出其优势。现有技术中，例如中国授权专利CN104678039A提供了一种基于液相色谱-串联质谱联用同时测定烟草及烟草制品中四种黄曲霉毒素含量的方法，该方法先将烟末样品用氯化钠和甲醇水溶液震荡提取，然后离心取上清液，用液相色谱法和串联质谱联用同时检测上清液中四种黄曲霉毒素的含量。然而，然而这种方法采用的免疫亲和柱价格昂贵，检测成本较高。又例如论文《超声辅助-分散液液微萃取_快速液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中黄曲霉毒素》(朱筱玲等，中国油脂，2019年第44卷第11期，97-101，107)中公开了利用了超声辅助、分散液液微萃取(UA—DLLME)、快速液相色谱、串联质谱法测定食用植物油中黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的方法。先将食用油用石油醚溶解混匀，然后用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液混合，超声萃取，静置分层后取底层溶液过滤后上机进行液相色谱和质谱联用检测。然而这种方法仅仅针对的对象是食用油，其样品前处理方式和液相色谱、质谱条件也不能适用于烟叶。
技术实现思路
针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，通过考察优化样品前处理条件，建立以甲醇-水溶液萃取、DLLME技术净化富集和LC-MS/MS定量分析的检测烟叶中多种生物毒素残留的方法，旨在为烟叶质量安全监控提供方法参考。具体通过以下技术实现。分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：S1、称取待测烟末样品置于离心管中，加入甲醇-水溶液，待测烟末样品用量为0.1g/ml，超声提取20min；S2、取上清液5ml，加入50mgC18吸附剂，涡旋震荡1min，离心取上层清液1.5ml，加入不少于300μl萃取剂，混合均匀，迅速注入5ml水中，超声振荡3-6min得到乳浊液；所述萃取剂为二氯乙烷和/或氯仿；S3、将步骤S2的乳浊液离心分层，取下层有机溶液，用氮气吹干得到固形物；S4、将步骤S2的固形物用100μl的50％甲醇-水溶液复溶制成待测液；S5、配置四种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的基质配标系列标准工作溶液，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测混合标准工作液中黄曲霉毒素，建立相应的标准曲线；S6、将步骤S4的待测液置于色谱瓶内，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测待测液中黄曲霉毒素的含量，根据步骤S5的标准曲线进行定量分析。本专利技术提供的上述方法将分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱方式运用在烟叶中四种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)和的定性定量测定。在分散液液微萃取过程(DLLME)中，待测物在萃取剂、分散剂和水形成三相乳浊液的过程中，通过大的接触面积迅速在各相间达到分配平衡，但是针对研究对象(例如烟叶)的不同，乳浊液形成状态也存在差异，制备待测液时，所需要的超声震荡时间以及采用的萃取剂(种类和用量)也明显不同。申请人研究了不同的超声振荡时间对目标物萃取效率的影响，发现振荡时间对萃取效率的影响很小，这说明在分散液液微萃取中，目标物在三相乳浊液中很快达到平衡。申请人还研究了二氯甲烷(CH2Cl2)、三氯甲烷(CHCl3，氯仿)、四氯化碳(CCl4)、二氯乙烷这4种萃取剂的萃取效果，发现采用二氯乙烷、四氯化碳作为萃取剂的萃取效果明显优于其他两种。申请人还分别以100、150、200、300和400μL的二氯乙烷做为萃取剂时，发现如果萃取剂体积太小，沉积在底部的有机相的量也很少，难以转移且重复性较差；当萃取剂体积加大后，萃取效率提升；加大至大于300μl后，萃取效率没有明显变化，经综合考虑选择萃取剂体积为300μL。针对现有技术中，有些待测样品在前处理时使用了氯化钠或氯化钠溶液，申请人考察了不同浓度的氯化钠水溶液(0、5％、10％、15％和20％；质量体积比)对目标物萃取效率的影响，发现随着氯化钠水溶液浓度越大，目标物萃取效率越差。因此，在烟末样品前处理时选择不添加氯化钠。优选地，上述方法的步骤S1中，甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比为7-8:3-2。优选地，液相色谱条件为：色谱柱为ZorbaxSB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，进样量10μL，柱温25℃，流速0.5ml/min；流动相A为10mmol/L乙酸铵-水溶液，流动相B为乙腈溶液；梯度洗脱的方式为0min，流动相B5％、10min，流动相B40％、15min，流动相B100％、20min，流动相B100％，运行5min；质谱条件为：电喷雾离子化正离子模式(ESI+)，检测方式为多反应监测(MRM)，离子源温度550℃，喷雾电压5500V，碰撞气压力7psi，气帘气压力30psi，辅助加热气压力60psi，加热气压力50psi。优选地，步骤S2中，萃取剂用量为300μl。优选地，步骤S2中，超声震荡的时间为5min。超声震荡的时间对最终的目标物萃取效率影响不大，为了提高效率一般选5min。优选地，其特征在于，步骤S5的基质配标系列标准工作溶液的制备方法为：移取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的3mg/L的标准样品苯溶液各1mL至容量瓶中，加入甲醇配制得到浓度为0.2μg/ml的混合标准储备液；分别移取0.025ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml混合标准储备液于各自容量瓶中，用甲醇定容制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、称取待测烟末样品置于离心管中，加入甲醇-水溶液，待测烟末样品用量为0.1g/ml，超声提取20min；/nS2、取上清液5ml，加入50mgC18吸附剂，涡旋震荡1min，离心取上层清液1.5ml，加入不少于300μl萃取剂，混合均匀，迅速注入5ml水中，超声振荡3-6min得到乳浊液；/n所述萃取剂为二氯乙烷和/或氯仿；/nS3、将步骤S2的乳浊液离心分层，取下层有机溶液，用氮气吹干得到固形物；/nS4、将步骤S2的固形物用100μl的50％甲醇-水溶液复溶制成待测液；/nS5、配置四种黄曲霉毒素AFB

【技术特征摘要】
1.分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、称取待测烟末样品置于离心管中，加入甲醇-水溶液，待测烟末样品用量为0.1g/ml，超声提取20min；
S2、取上清液5ml，加入50mgC18吸附剂，涡旋震荡1min，离心取上层清液1.5ml，加入不少于300μl萃取剂，混合均匀，迅速注入5ml水中，超声振荡3-6min得到乳浊液；
所述萃取剂为二氯乙烷和/或氯仿；
S3、将步骤S2的乳浊液离心分层，取下层有机溶液，用氮气吹干得到固形物；
S4、将步骤S2的固形物用100μl的50％甲醇-水溶液复溶制成待测液；
S5、配置四种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的基质配标系列标准工作溶液，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测混合标准工作液中黄曲霉毒素，建立相应的标准曲线；
S6、将步骤S4的待测液置于色谱瓶内，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测待测液中黄曲霉毒素的含量，根据步骤S5的标准曲线进行定量分析。


2.根据权利要求1所述的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤S1中，甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比为7-8:3-2。


3.根据权利要求1所述的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，液相色谱条件为：色谱柱为ZorbaxSB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，进样量10μL，柱温25℃，流速0.5ml/min；流动相A为10mmol/L乙酸铵-水溶液，流动相B为乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：王康，陈慧，肖少红，
申请(专利权)人：中国烟草总公司湖北省公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42