【技术实现步骤摘要】
一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其构建方法、培养方法与应用
本专利技术属于基因
，涉及一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其构建方法、培养方法与应用。
技术介绍
α-葡聚糖酶(Dextranase，1,6-α-D-glucan-6-glucanohydrolase；EC3.2.1.11)也被称为右旋糖酐酶，能够随机水解葡聚糖中的α-1,6糖苷键，终产物包括异麦芽糖、异麦芽三糖和葡萄糖以及痕量的多聚糖。α-葡聚糖酶分为两类，内切α-葡聚糖酶(endodextranases)水解葡聚糖内部的糖苷键；外切α-葡聚糖酶(exodextranases)从葡聚糖的非还原端切割，终产物一般为异麦芽糖或异麦芽三糖等。众多微生物都可产α-葡聚糖酶，包括青霉、曲霉、细丽毛壳、镰刀霉菌、申克孢子丝菌、斯达油脂酵母、口腔拟杆菌、嗜热厌氧杆菌、链球菌等。目前商品化的α-葡聚糖酶主要是通过青霉属(Penicillium)和毛壳属(Chaetomium)等真菌的培养物得到。与此同时，利用基因工程菌生产外源蛋白也极具发展前景。在α...
【技术保护点】
1.一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris)dip 1，已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61378。/n
【技术特征摘要】
1.一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)dip1，已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61378。
2.权利要求1所述的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1在生产α-葡聚糖酶中的应用。
3.一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)单倍体产酶工程菌KM-HZ的构建：根据朱黄青霉α-葡聚糖酶氨基酸序列(GenBankGI:37927147)，将其经密码子优化后合成α-葡聚糖酶基因dex，α-葡聚糖酶基因dex经酶切，与质粒pGAPZαA连接，构建得到重组表达质粒pGAPZαA-dex，经测序验证，序列正确；表达载体pGAPZαA-dex使用AvrII单酶切，使之线性化，电击转化感受态毕赤酵母KM71H，在含有博来霉素的YPD平板上筛选得到阳性克隆，得到工程菌KM-HZ；
(2)单倍体产酶工程菌KM-HK的构建：对质粒pGAPZαA进行改造，将其原有的博来霉素抗性基因及相应调控序列替换为卡那霉素抗性基因及相应调控序列，得到新的质粒pGK；
步骤(1)所述合成的α-葡聚糖酶基因dex经酶切，与pGK质粒连接，构建得到重组表达质粒pGK-dex，经测序验证，序列正确；表达载体pGK-dex使用AvrII单酶切，使之线性化，电击转化感受态毕赤酵母KM71H，在含有遗传霉素的YPD平板上筛选得到阳性克隆，得到工程菌KM-HK；
(3)将工程菌KM-HZ、工程菌KM-HK分别在YPD平板上划线，培养，分别用无菌水将上述平板上的菌落洗下，然后充分混合，混合后的菌液涂布于接合培养基平板，培养；刮取适量菌落，放入无菌水中充分混合，涂布于筛选培养基，培养，长出的阳性克隆，得到二倍体工程菌，命名为产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)dip1，该菌株已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61378。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的α-葡聚糖酶基因片段dex通过如下方法得到：根据朱黄青霉α-葡聚糖酶氨基酸序列(GenBankGI:37927147)，综合考虑毕赤酵母密码子的使用偏爱性，基因的GC含量以及mRNA的二级结构，经密码子优化后合成α-葡聚糖酶基因dex。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的合成α-葡聚糖酶基因dex所用的引物为：
引物P1：CGCGAATTCCATGGTACTACAGCTAACACAC；
引物P2：TGAATGCGGCCGCAGAAATTTGCCACTCTCC；
步骤(1)...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄曾慰，梁达奉，常国炜，刘桂云，黎志德，张九花，
申请(专利权)人：广东省科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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