一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌，是以球拟假丝酵母CGMCC 1576为出发菌株，敲除其响应pH相关的蛋白rlp基因和调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1获得，其基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1；其中所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。本发明专利技术还公开了所述工程菌株在发酵生产槐糖脂中的应用，实验证实该工程菌株摇瓶发酵后槐糖脂产量达到102g/L，比野生型菌株提高了57.19％，尤其是内酯型槐糖脂产量提高了25.25％。本发明专利技术所提供的对三个基因同时敲除获得高产槐糖脂菌株的方法及菌株为开发基因工程菌并大规模工业化生产槐糖脂进一步满足市场需求提供了途径。

【技术实现步骤摘要】
一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程

技术介绍
槐糖脂是一种生物表面活性剂，它们具有很好的环境相容性和生物相容性，可生物降解性，低毒性，是一种环境友好的表面活性剂。由于槐糖脂的这些特性，它们能够广泛应用于日化、食品、环境保护、石油开采等工业。相比于化学合成的表面活性剂，槐糖脂不仅具有良好的表面活性，同时也具有独特的生物活性，主要体现在其具有抗细菌和真菌活性，可以治疗败血症、抑制皮肤癣菌的生产，具有抗肝癌、食管癌、宫颈癌等活性(申请人课题组先前的专利)。不同结构的槐糖脂分子具有不同的生物学活性，酸型槐糖脂具有良好的润湿，乳化和发泡能力等表面活性，而内酯型槐糖脂则具有更好的降低表面张力和抗菌，抗炎，抗病毒等生物学活性。申请人先前的专利报道槐糖脂可以利用拟威克酵母变种(Wickerhamielladomercqiaevar.sophorolipid)CGMCC1576发酵制得，相关拟威克酵母变种后更名为球拟假丝酵母Starmerellabo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌，其特征在于：所述高产槐糖脂的三基因敲除的工程菌株是以球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC 1576为出发菌株，敲除其响应pH相关的蛋白rlp基因和两个转录因子基因即调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1获得，其基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1；其中所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌，其特征在于：所述高产槐糖脂的三基因敲除的工程菌株是以球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC1576为出发菌株，敲除其响应pH相关的蛋白rlp基因和两个转录因子基因即调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1获得，其基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1；其中所述rlp基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。


2.权利要求1所述高产槐糖脂的三基因敲除工程菌的构建方法，步骤是：
(1)敲除盒的构建：对球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC1576中响应pH相关的蛋白rlp基因和调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1两个转录因子基因，分别使用高保真酶MaxSuper-FidelityDNAPolymerase扩增基因rlp、leu3、ztf1编码区的上下游同源臂序列，以潮霉素筛选标记自删除质粒pRSH为模板，用引物对rec-hphfor/rec-hphrev扩增含有自删除系统的hph抗性表达盒；采用OMEGAGelExtractionKit胶回收试剂盒纯化rlp上游同源臂、潮霉素表达盒和下游同源臂三个目的片段，利用Double-jointPCR将纯化得到的rlp上下游同源臂和潮霉素表达盒进行融合PCR，再采用引物对rlp-gfor/rlp-grev进行巢式PCR扩增，最终获得rlp基因敲除盒；与rlp基因敲除盒的构建过程相同，使用引物对leu3-5’flankingfor/leu3-5’flankingrev，和leu3-3’flankingfor/leu3-3’flankingrev扩增得到leu3的敲除盒上下游同源臂；使用引物对ztf1-5’flankingfor/ztf1-5’flankingrev，和ztf1-3’flankingfor/ztf1-3’flankingrev扩增得到ztf1的敲除盒上下游同源臂；leu3和ztf1的所有片段经切胶回收纯化后，利用Double-jointPCR方法进行融合扩增，再分别采用引物对leu3-gfor/leu3-grev、ztf1-gfor/ztf1-grev进行巢式PCR扩增，获得leu3和ztf1基因敲除盒；其中，所述rlp基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述ztf1...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋欣，刘君，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37