高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用。该工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达ARO4

【技术实现步骤摘要】
高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用
本专利技术涉及代谢工程和发酵
，特别涉及一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用。
技术介绍
紫杉叶素(Taxifolin)是一种天然的二氢黄酮醇类化合物，又名花旗松素和二氢槲皮素。紫杉叶素具有抗癌、抗菌、清除自由基的能力。最近也有研究证明，紫杉叶素具有神经损伤保护的功能，特别是对阿尔茨海默病引起的淀粉样蛋白病变具有缓解作用。因此，紫杉叶素也被广泛的用于食品领域，并被开发成保健品。此外，紫杉叶素也可以作为前体原料，用于生产保肝药物水飞蓟素。因为其较高的市场需求，紫杉叶素的价格也高达1.5～2万元每公斤。目前，紫杉叶素主要从花旗松的针叶中提取获得。但紫杉叶素在植物中含量较低，提取后的纯化过程较为复杂，需要使用大量的有机试剂。此外，花旗松的生长周期较长，容易受到气候和产地的制约。大量的野生植物开采也会对生态平衡产生不良影响。同时，因为紫杉叶素结构较为复杂，使用有机合成的方式副产物较多，且产率较低，并且有机合成得到的紫杉叶素也较难为消费者所接受。基于植物提取和化学合成的弊端，寻找紫杉叶素的替代来源极为重要。通过现代生物技术，构建可以生产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌是一个最佳选择。将植物中紫杉叶素的生物合成相关酶的外源性基因高效多拷贝的组装到酵母的染色体上，以及对酵母中内源基因进行优化是核心技术。目前随着新的整合技术的发展，将外源性的基因多拷贝高效率的组装到酿酒酵母染色体上已经相对成熟，为实现构建该类酿酒酵母工程菌提供了技术支持。并且，而通过微生物工厂发酵的方法得到的紫杉叶素也可以作为一种绿色天然食品。本专利技术中，公开了一种高产紫衫叶素的酿酒酵母YT1041的构建方法，将紫杉叶素的生物合成途径关键酶基因多拷贝的整合到了酿酒酵母的染色体上，并对代谢途径进行优化，提高紫杉叶素的生产效率。同时，通过补料发酵技术，该菌株可以生产高达331mg/L的紫杉叶素。发酵液通过大孔树脂进行纯化分离，紫杉叶素的提取效率和纯度都可以达到90％以上。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌。本专利技术的另一目的在于提供所述高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的构建方法。本专利技术的再一目的在于提供所述高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌，以酿酒酵母为出发菌株，过表达ARO4K229L、ARO7G229S、ARO8、TYR1、BDH1E221S/I222R/A223S、4CL1、F3H、F3’H、CPR、CHI、TAL和CHS基因；其中，所述的ARO4K229L为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；所述的ARO7G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；所述的BDH1E221S/I222R/A223S为BDH1基因的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸。所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。所述的ARO4、ARO7、ARO8、TYR1和BDH1基因可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到；其中，ARO4的核苷酸序列如GenBank:NM_001178597.1所示；ARO7的核苷酸序列如GenBank:NM_001184157.1所示；ARO8的核苷酸序列如GenBank:NM_001181067.1所示；TYR1的核苷酸序列如GenBank:NM_001178514.1所示；BDH1的核苷酸序列如GenBank:NM_001178202.2所示。所述的4CL1、F3H、F3’H和CPR基因可以以拟南芥cDNA为模板克隆得到，其中，4CL1的核苷酸序列如GenBank:AY376729所示；F3H的核苷酸序列如GenBank:NM_114983.3所示；F3’H的核苷酸序列如GenBank:NM_120881.3所示；CPR的核苷酸序列如GenBank:NM_118585.4所示。所述的CHI的核苷酸序列如GenBank:XM_003592713.3所示。所述的TAL的核苷酸序列如GenBank:KR095308.1所示。所述的CHS的核苷酸序列如GenBank:AF233638.1所示。所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)利用重叠PCR构建以下模块和基因片段(a)将PTDH3、TAL和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-TAL-TTDH2；(b)将PPGK1、ARO4K229L和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-ARO4K229L-TADH1；(c)将PTEF1、ARO7G229S和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-ARO7G229S-TCYC1；(d)将表达模块PTDH3-TAL-TTDH2、PPGK1-ARO4K229L-TADH1和PTEF1-ARO7G229S-TCYC1顺序连接，得到基因片段TAA；(e)将PTDH3、4CL1和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-4CL-TTDH2；(f)将PPGK1、CHS和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-CHS-TADH1；(g)将PTEF1、CHI和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-CHI-TCYC1；(h)将表达模块PTDH3-4CL-TTDH2、PPGK1-CHS-TADH1和PTEF1-CHI-TCYC1顺序连接，得到基因片段4CC；(i)将PTDH3、F3H和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-F3H-TTDH2；(j)将PPGK1、F3’H和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-F3’H-TADH1；(k)将PTEF1、CPR和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-CPR-TCYC1；(l)将表达模块PTDH3-F3H-TTDH2、PPGK1-F3’H-TADH1和PTEF1-CPR-TCYC1顺序连接，得到基因片段FFA；(m)将PTDH3、BDH1E221S/I222R/A223S和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2；(n)将PPGK1、TYR1和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-TYR1-TADH1；(o)将PTEF1、ARO8和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-ARO8-TCYC1；(p)将表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2、PPGK1-TYR1-TADH1和PTEF1-ARO8-TCYC1顺序连接，得到基因片段BTA；(2)构建载体(I)利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切pCfB2797载体，得到线性化pCfB2797载体；然后将步骤(d)中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌，其特征在于：以酿酒酵母为出发菌株，过表达ARO4

【技术特征摘要】
1.一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌，其特征在于：以酿酒酵母为出发菌株，过表达ARO4K229L、ARO7G229S、ARO8、TYR1、BDH1E221S/I222R/A223S、4CL1、F3H、F3’H、CPR、CHI、TAL和CHS基因；其中，
所述的ARO4K229L为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；
所述的ARO7G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；
所述的BDH1E221S/I222R/A223S为BDH1基因的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸。


2.根据权利要求1所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。


3.权利要求1所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用重叠PCR构建以下模块和基因片段
(a)将PTDH3、TAL和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-TAL-TTDH2；
(b)将PPGK1、ARO4K229L和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-ARO4K229L-TADH1；
(c)将PTEF1、ARO7G229S和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-ARO7G229S-TCYC1；
(d)将表达模块PTDH3-TAL-TTDH2、PPGK1-ARO4K229L-TADH1和PTEF1-ARO7G229S-TCYC1顺序连接，得到基因片段TAA；
(e)将PTDH3、4CL1和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-4CL-TTDH2；
(f)将PPGK1、CHS和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-CHS-TADH1；
(g)将PTEF1、CHI和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-CHI-TCYC1；
(h)将表达模块PTDH3-4CL-TTDH2、PPGK1-CHS-TADH1和PTEF1-CHI-TCYC1顺序连接，得到基因片段4CC；
(i)将PTDH3、F3H和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-F3H-TTDH2；
(j)将PPGK1、F3’H和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-F3’H-TADH1；
(k)将PTEF1、CPR和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-CPR-TCYC1；
(l)将表达模块PTDH3-F3H-TTDH2、PPGK1-F3’H-TADH1和PTEF1-CPR-TCYC1顺序连接，得到基因片段FFA；
(m)将PTDH3、BDH1E221S/I222R/A223S和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2；
(n)将PPGK1、TYR1和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-TYR1-TADH1；
(o)将PTEF1、ARO8和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-ARO8-TCYC1；
(p)将表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2、PPGK1-TYR1-TADH1和PTEF1-ARO8-TCYC1顺序连接，得到基因片段BTA；
(2)构建载体
(I)利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切pCfB2797载体，得到线性化pCfB2797载体；然后将步骤(d)中得到的基因片段TAA连接到线性化pCfB2797载体上，得到质粒pCfB2797TAA；
(II)利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切载体pCfB2798，得到线性化pCfB2798载体；然后将步骤(h)中得到的基因片段4CC连接到线性化pCfB2798载体上，得到质粒pCfB27984CC；
(III)利用限制性内切酶Pst1切酶pCfB2989载体；得到线性化pCfB2798载体，然后将MET筛选标签基因片段连接到线性化pCfB2798载体上，得到质粒pCfB2798m；再利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切载体pCfB2989m，得到线性化pCfB2989m载体；然后将步骤(l)中得到的基因片段FFA连接到线性化pCfB2989m载体上，得到质粒pCfB2989mFFA；
(IV)将His筛选标签基因片段连接到pEASY-Blunt载体上，得到质粒p-YJZ-His；然后利用限制性内切酶AvaI酶切质粒p-YJZ-His，得到线性化p-YJZ-His载体；然后将步骤(p)中得到的基因片段BTA连接到线性化p-YJZ-His载体上，得到质粒p-HBTA；
(3)构建菌株YC1041
(A)将质粒pCfB2797TAA用限制性内切酶NotI线性化后转化酿酒酵母BY4741，筛选得到酿酒酵母YT1003；
(B)将质粒pCfB2798...

【专利技术属性】
技术研发人员：訾佳辰，杨加增，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44