一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明专利技术的毕赤酵母工程菌可用于生产共轭亚油酸，将本发明专利技术的毕赤酵母工程菌发酵获得的含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液添加至含0.9g/L游离亚油酸的反应体系中进行反应，仅反应3h，即可使反应液中共轭亚油酸的产量高达0.855g/L、转化率高达95％，并且，反应中的共轭亚油酸全部为cis9,trans11‑CLA，无其他共轭亚油酸异构体。

【技术实现步骤摘要】
一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用
本专利技术涉及一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程

技术介绍
共轭亚油酸(Conjugatedlinoleicacid，CLA)是一组含有共轭双键的十八碳二烯酸的总称，是亚油酸(Linoleicacid，LA)的立体几何异构体。由于共轭双键位置不同且双键具有顺式及反式两种几何结构，共轭亚油酸的种类十分丰富。在共轭亚油酸的众多异构体中，cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA被证实具有重要的生理活性，例如，研究表明，cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA均具有抗癌的生理活性，其中，cis9,trans11-CLA的抗癌能力更强(具体可见参考文献：DurgamVR，FernandesG.ThegrowthinhibitoryeffectofconjugatedlinoleicacidonMCF-7cellsisrelatedtoestrogenresponsesystem.CancerLetters，1997，116(2):121-130[2]ParizaMW.Conjugatedlinoleicacid,anewlyrecognizednutrient[J].Chemistry&industry,1997,12:464-4.)，并且，研究表明，cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA均具有调节体脂的作用，其中，trans10,cis12-CLA可显著降低脂肪含量，而cis9,trans11-CLA可显著降低脂肪含量(具体可见参考文献：RodriguezE，RibotJ，PalouA.Trans-10,cis-12,butnotcis-9,trnas-11CLAisomerinhibitsbrownadipocytethermogeniccapacity.AmericanJournalofPhysiology，2002，282(6):R1789-R1797.和BouthegourdJC，EvenPC，GripoisD，etal.ACLAmixturepreventsbodytriglycerideaccumulationwithoutaffectingenergyexpenditureinsyrianhamsters.TheJournalofNutrition，2002，132(9):2682-2689.)，因此，CLA已成为食品、药品、化妆品等行业的研究热点，在食品、药品、化妆品等领域拥有极大的应用前景，而为了更好地研究和利用CLA，合成高纯度的CLA单体，尤其是高纯度的cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体势在必行。CLA在自然界中含量较少，主要存在于反刍动物牛、羊等的肉和奶及其制品中，非反刍动物及其它食品中含量较少。为了获得大量的CLA，人工合成法是最有效的途径。目前，关于CLA的合成方法很多，主要有生物合成和化学合成两种方法。其中，化学合成法主要是通过碱异构化、过渡金属催化相应的底物获得CLA，但是，利用化学合成法获得CLA的过程会产生很多有毒性的副产物，这些副产物对环境以及人体均具有毒害作用，并且，利用化学合成法制备得到的共轭亚油酸异构体种类多，很难进行有效的分离(具体可见参考文献：Philippaerts,A.,VanAelst,J.,Sels,B.,2013.Conjugatedlinoleicacidsandconjugatedvegetableoils:fromnutraceuticaltobio-polymer.Eur.J.LipidSci.Technol.115,717–720.和Nicod,N.,Parker,R.S.,Giordano,E.,Maestro,V.,Davalos,A.,Visioli,F.,2015.IsomerspecificeffectsofconjugatedlinoleicacidonHDLfunctionalityassociatedwithreversecholesteroltransport.J.Nutr.Biochem.26,165-172.)，因此，化学合成法无法真正实现高纯度CLA单体，尤其是高纯度cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体的大规模工业化生产。生物合成法则主要是通过采用特定的酶或微生物催化相应的底物获得CLA，其具有污染少，合成的CLA异构体种类较为单一的优势，但是，该方法也存在明显的缺陷，例如，利用微生物催化相应的底物获得CLA时所涉及的菌株多为双歧杆菌等严格厌氧菌，严格厌氧菌在工业或实验室中不易培养且产量较低，难以广泛应用到食品、药品、化妆品中；利用酶催化相应的底物获得CLA时需同时使用多种酶，多酶催化中间产物多、途径复杂，不适合CLA的工业化生产。另外，虽然利用生物合成法生产得到的CLA异构体种类较为单一，但是，其距离获得高纯度的CLA单体，尤其是高纯度的cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体仍有一定的距离。上述缺陷使得现有的生物合成法无法真正实现高纯度CLA单体，尤其是高纯度cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体的大规模工业化生产，因此，急需找到一种产量高的生产高纯度CLA单体，尤其是高纯度cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体的方法以克服现有生物合成法存在的缺陷。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种产量高的生产共轭亚油酸单体，尤其是cis9,trans11-CLA单体的方法。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母为宿主表达编码亚油酸异构酶的基因；所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母PichiaPinkTMStrain2。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述毕赤酵母工程菌以PichiapPink-HC-3CZHEK质粒为表达载体；所述PichiapPink-HC-3CZHEK质粒是通过将去除α-factor后的pPinkα-HC质粒与3CZHEK基因相连获得的。在本专利技术的一种实施方式中，所述3CZHEK基因的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。本专利技术还提供了一种生产共轭亚油酸的方法，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液；将含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；或者，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母为宿主表达编码亚油酸异构酶的基因；所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母为宿主表达编码亚油酸异构酶的基因；所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.如权利要求1所述的一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母PichiaPinkTMStrain2。


3.如权利要求1或2所述的一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述编码亚油酸异构酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。


4.如权利要求1-3任一所述的一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌以PichiapPink-HC-3CZHEK质粒为表达载体；所述PichiapPink-HC-3CZHEK质粒是通过将去除α-factor后的pPinkα-HC质粒与3CZHEK基因相连获得的。


5.一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1-4任一所述的毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液；将含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；
或者，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液；将含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液进行分离，得到亚油酸异构酶；将亚油酸异构酶添加至含亚油酸的反应体系中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海琴，杨波，赵建新，李秀清，高鹤，张灏，陈卫，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32