一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建制造技术

本发明专利技术公开了一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建，属于基因工程技术领域。本发明专利技术首先实现了不同动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达，构建得到表达猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白、大豆血红蛋白以及猪血红蛋白β单亚基的重组菌，在摇瓶条件下产量分别达到42.0mg/L、20.0mg/L、5.0mg/L、100.0mg/L与1.0mg/L；并进一步优化猪肌红蛋白在毕赤酵母中的分泌表达体系，最终构建得到的重组菌株X33‑△ku70‑△yps1‑1‑MB菌株48h摇瓶发酵产量达到69.0mg/L，较对照提高了59.4％。本发明专利技术有利于不同来源肌红蛋白/血红蛋白在人造肉等在食品加工领域的应用及进一步发展。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建
本专利技术涉及一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建技术，属于基因工程

技术介绍
血红蛋白是自然界中普遍存在的血红素结合蛋白，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，更赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉制品的兴起，为了模拟真肉的颜色和风味，需要在产品中添加血红蛋白。除此之外，肌红蛋白也被证实和真肉的肉色形成存在密切的关系。因此，随着在人造肉领域中越来越广泛的应用，国内外市场对肌红蛋白/血红蛋白的需求量也在不断增加。肌红蛋白/血红蛋白的获取主要有两种途径。第一，从畜禽血中提取，但是这种方法由于需要使用多种有害化学试剂且提取工艺复杂，并不适合大规模工业化生产。第二，利用微生物细胞工厂异源合成血红蛋白。由于生物合成法具有低成本、条件温和、环境友好等优点，因此成为肌红蛋白/血红蛋白合成的首选方法。毕赤酵母以其具有显著优势的蛋白表达系统(高效分泌、低蛋白糖基化以及高密度培养等)，被广泛应用于食品与制药领域。与常见的细菌宿主大肠杆菌相比，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力。毕赤酵母表达合成系统是较早被开发的真核基因表达体系，目前已成功实现了动植物、细菌、病毒、真菌等外源基因的表达。因此，应用毕赤酵母表达系统来合成动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白是最佳的选择。目前，利用毕赤酵母虽然可以实现大豆血红蛋白的合成，但由于采用的是胞内表达形式产率较低且不易于纯化(纯度<;65％)，应用于人造肉食品的添加存在一定的安全隐患；而其它不同来源的肌红蛋白/血红蛋白(猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白或猪血红蛋白)在毕赤酵母中的合成还未见报道。
技术实现思路
针对目前存在的问题，本专利技术首先在毕赤酵母中尝试分泌表达不同来源的肌红蛋白/血红蛋白(猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白、大豆血红蛋白或猪血红蛋白)；然后对猪肌红蛋白分泌表达体系进行优化(表达载体、发酵时间、毕赤酵母表达宿主、基因拷贝数以及重组蛋白促溶标签)，敲除毕赤酵母发酵过程中主要降解重组蛋白的蛋白酶基因(pep4、yps1-1与prb1)，从而进一步提高猪肌红蛋白的分泌表达量，由于蛋白分泌至胞外，简化了蛋白分离、纯化的过程。本专利技术的第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌是利用毕赤酵母异源表达单拷贝、双拷贝或三拷贝的肌红蛋白或血红蛋白，所述肌红蛋白来源于但不限于猪、牛，所述血红蛋白来源于但不限于三叶草、大豆或猪。在一种实施方式中，所述毕赤酵母也可替换为其它同源性接近的酵母属菌种，包括但不限于毕赤酵母突变株和葡萄汁酵母(S.uvarum)。在一种实施方式中，以毕赤酵母X33、毕赤酵母KM71、毕赤酵母SMD1168或毕赤酵母GS115为宿主；所述肌红蛋白或血红蛋白以pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC或pPIC9K为表达载体。在一种实施方式中，编码猪肌红蛋白MB基因的GeneID:397467；编码牛肌红蛋白MB基因的GeneID:280695；编码三叶草血红蛋白HB基因的GenBank:GAU42437.1；编码大豆血红蛋白c2基因的GeneID:100527379；编码猪血红蛋白α亚基HBA1基因的GeneID:110259958、β亚基HBB基因的GeneID:407066。在一种实施方式中，密码子优化后的编码猪肌红蛋白MB基因、编码牛肌红蛋白MB基因、编码三叶草血红蛋白HB基因、编码大豆血红蛋白c2基因、编码猪血红蛋白α亚基HBA1基因、编码猪血红蛋白β亚基HBB基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。在一种实施方式中，所述重组菌还包括如(a)～(c)所述的一种或多种特征：(a)将所述肌红蛋白或血红蛋白与促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA融合表达；(b)敲除毕赤酵母基因组中的ku70基因，所述ku70基因的GeneID:8199462；(c)敲除毕赤酵母基因组中的蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一个或多个。在一种实施方式中，利用促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA与目的蛋白融合表达。在一种实施方式中所述促溶标签为MBP、TrxA或NusA。在一种实施方式中，在敲除毕赤酵母基因组中ku70基因的同时，还敲除了蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一种或多种。在一种实施方式中，敲除pep4、yps1-1或prb1；或者，同时敲除pep4和yps1-1；或者，同时敲除pep4、yps1-1和prb1。在一种实施方式中，所述蛋白酶基因pep4的GeneID:8200047，所述蛋白酶基因yps1-1的GeneID:8196641，所述蛋白酶基因prb1的GeneID:8196728。本专利技术的第二个目的是提供一种胞外表达肌红蛋白或血红蛋白的方法，所述方法是利用所述重组菌发酵生产肌红蛋白或血红蛋白。在一种实施方式中，将所述重组菌在YPD培养基中培养至OD600＝2～6，收集细胞，用发酵培养基重悬细胞，在25～35℃、100～600rpm下发酵24～120h。在一种实施方式中，初始发酵时培养基中含有终浓度为10～50mg/L的血红素。在一种实施方式中，每24h添加一次甲醇，使得甲醇在发酵体系中的终浓度为1％(v/v)。在一种实施方式中，所述发酵培养基包括但不限于YNB、YPD、BMM或BMMY培养基。本专利技术的第三个目的是提供提升肌红蛋白或血红蛋白表达量的方法，是利用毕赤酵母异源表达单拷贝的肌红蛋白基因或血红蛋白基因。在一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。在一种实施方式中，将促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA与目的蛋白融合表达。在一种实施方式中，将MBP、NusA或TrxA与目的蛋白融合表达。在一种实施方式中，敲除毕赤酵母X33基因组中的ku70基因，所述ku70基因的GeneID:8199462。在一种实施方式中，敲除毕赤酵母X33基因组中的蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一个或多个。在一种实施方式中，敲除pep4、yps1-1或prb1；或者，同时敲除pep4和yps1-1；或者，同时敲除pep4、yps1-1和prb1。本专利技术的第四个目的是提供所述重组菌在制备肌红蛋白或血红蛋白或其衍生物中的应用。有益效果：本专利技术首先实现了不同动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白在毕赤酵母中的高效表达，构建得到的基因工程菌X33-pPICZαA-MB(Susscrofa)、GS115-pPIC9K-MB(BosTaurus)、X33-pPICZαA-HB(Trifoliumsubterraneum)、X33-p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组菌，其特征在于，利用毕赤酵母异源表达1～3个拷贝数的肌红蛋白或血红蛋白；所述肌红蛋白来源于但不限于猪、牛，所述血红蛋白来源于但不限于三叶草、大豆或猪。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，其特征在于，利用毕赤酵母异源表达1～3个拷贝数的肌红蛋白或血红蛋白；所述肌红蛋白来源于但不限于猪、牛，所述血红蛋白来源于但不限于三叶草、大豆或猪。


2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，以毕赤酵母X33、毕赤酵母KM71、毕赤酵母SMD1168或毕赤酵母GS115为宿主；所述肌红蛋白或血红蛋白以pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC或pPIC9K为表达载体。


3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还包括如(a)～(c)所述的一种或多种特征：
(a)将所述肌红蛋白或血红蛋白与促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA连接；
(b)敲除毕赤酵母基因组中的ku70基因，所述ku70基因的GeneID:8199462；
(c)敲除毕赤酵母基因组中的蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一个或多个。


4.一种胞外表达肌红蛋白或血红蛋白的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一项所述重组菌发酵生产肌红蛋白或血红蛋白。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵鑫锐，余飞，王紫微，周景文，堵国成，陈坚，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32