富集分离浮萍中内生固氮菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，包括以下步骤：使用组织表面灭菌液对清洗后的浮萍进行表面灭菌，经研磨后过滤，得到滤液；将滤液置于固氮培养液中培养富集内生固氮菌群；对培养液进行梯度稀释后，在96孔培养板中培养得到菌液，进行PCR扩增，测序，鉴定；根据PCR测序结果是否有杂带，判断是否为单一内生固氮菌。本发明专利技术的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法有助于挖掘更多功能固氮菌提高浮萍生长速率，以及加快富营养化水体中氮素的吸收和降解重金属等水环境污染等问题，对浮萍水体修复和水环境净化具有重要意义，使水环境生态体系向更高水平的生物多样性和更稳定的自我调节机制方向发展。定的自我调节机制方向发展。定的自我调节机制方向发展。

【技术实现步骤摘要】
富集分离浮萍中内生固氮菌的方法


[0001]本专利技术属于细菌功能研究
，更具体地说，本专利技术涉及一种富集分离浮萍组织中的内生固氮菌的方法。

技术介绍

[0002]植物内生细菌是植物生长促进与抗逆防病的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景，已成为植物学、微生物学、植物保护学等多学科的研究热点。内生菌定植于植物体内，与宿主植物形成共生关系，对植物的生长和健康起到至关重要的作用。因此，有关植物内生菌的研究正成为国内外环境、生物、化学等领域的焦点。
[0003]植物内生菌普遍存在于植物体的各个部位且种类繁多，而人们对这些内生菌的栖息部位和种类多样性仍然知之甚少。因而，为了充分开发利用植物内生菌及其代谢产物资源，首先必须实现植物内生菌的完全、准确的分离。然而目前对植物内生菌的研究多集中于陆生植物，对水生植物的内生菌富集与分离研究相对较少。
[0004]随着工业和农业的飞速发展，氮磷资源的过度使用，导致河、湖等水体富营养化程度加剧。浮萍(Duckweed)是一种环境适应能力强的水生植物，具有生长速率快、氮磷吸收能力强等特点。近年来研究发现，从浮萍分离的多株内生菌够提高浮萍生长速率、加快富营养化水体中氮磷的吸收和降解重金属等。因此，挖掘浮萍内生功能菌包括固氮菌、溶磷菌等对解决富营养化水体中氮素的吸收和降解重金属等水环境污染等问题，使水环境生态体系向更高水平的生物多样性和更稳定的自我调节机制方向发展提供重要意义。
[0005]传统的分离纯化内生固氮菌的方法是平板划线分离法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作"由点到线"稀释而达到分离的目的。具体的方法是：先是将材料表面进行灭菌，清除表面的附生菌，再置于固氮培养基中培养，用接种环将混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
[0006]传统的分离纯化内生固氮菌的方法，通常使用过氧化氢，乙醇，升汞等消毒剂进行表面灭菌，这样的消毒剂对植物体本身是有伤害的，会导致植物体内产生活性氧，进而也会对植物内生菌造成不良影响。也有使用配制的化学洗涤剂配合灭菌液进行表面灭菌的报道，然而，单独使用化学洗涤液不能清除附生菌，单独使用配套的灭菌液，如果浓度不合适，会将目标内生菌一起清除掉，两者配合使用，虽然能够达到清除附生菌的效果，但是溶液成分过多，配制起来很复杂，处理步骤繁琐耗时。找到一种简单的、能彻底清除附生菌，而又不影响内生菌的组织表面灭菌液非常重要。
[0007]更为重要的一点是：本申请的专利技术人经过长期的研究中发现，相对于陆生植物生活的土壤环境，水体中的微生物少很多，因而黏附在水生植物根系或叶片的微生物种群和含量并不多，内生菌则更少。因此，采用传统的平板划线分离筛选内生固氮菌的方法，难以富集内生固氮菌，不能充分获得目标菌。如何能够富集分离到浮萍中内生固氮菌，需要新的
方法和策略。

技术实现思路

[0008]基于此，本专利技术的目的之一是提供一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，该方法可以快速且完全、准确地富集并分离浮萍中的内生固氮菌。
[0009]实现上述专利技术目的的具体技术方案如下：
[0010]一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，包括以下步骤：
[0011](1)、使用组织表面灭菌液对浮萍进行表面灭菌后，于0.1％～1％PBS中机械研磨，过滤，得到滤液；
[0012](2)、将滤液置于固氮培养液中富集培养5天～7天，离心，弃上清，得到富集的固氮菌群；
[0013](3)、在96孔培养板中加入固氮培养液，按梯度分别添加步骤(2)中经富集培养的培养液，培养5天～7天得到菌液，再分别吸取菌液作为反应模板，添加至96孔PCR板，进行PCR扩增，测序；
[0014](4)、PCR测序结果无杂带的菌液，即为单一内生固氮菌；PCR测序结果有杂带的菌液，在固氮培养基上划线分离纯化至得到单一内生固氮菌。
[0015]在其中一些实施例中，步骤(3)中所述梯度为：100μL固氮培养液中分别添加50μL、20μL、10μL、5μL、1μL和0.5μL的培养液。
[0016]在其中一些实施例中，步骤(3)中所述PCR扩增的引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
[0017]在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：2μL～4μL菌液、5μL细菌细胞裂解液、2μL～3μL 10x PCR buffer缓冲液、0.3mM～0.6mM MgCl2、0.1mM～0.3mM dNTPs、引物各0.5μM～1.0μM、0.3μL～0.6μL 5U/μLTaq聚合酶，加无菌ddH2O至25μL。
[0018]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述组织表面灭菌液包括以下组分：0.5
×
～1.5
×
PBS、体积百分浓度0.2％～0.4％的Triton
‑
X100、质量体积浓度3％～6％的次氯酸钠，pH6.5～7.0。
[0019]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述组织表面灭菌液包括以下组分：1
×
～1.5
×
PBS，体积百分浓度0.3％～0.4％的Triton
‑
X100、质量体积浓度4％～6％的次氯酸钠，pH6.8～7.0。
[0020]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述表面灭菌的方法为：在组织表面灭菌液中加入浮萍，1500rpm～2500rpm振荡清洗3min～5min，倒去组织表面灭菌液，再加入无菌水，1500rpm～2500rpm振荡清洗1min～2min，重复2～3次。
[0021]在其中一些实施例中，步骤(1)中确定所述浮萍表面灭菌是否彻底的方法为：将无菌水清洗浮萍后的清洗液，滴至细菌培养基LB中，若无菌落形成，则表示浮萍表面已彻底灭菌。
[0022]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述研磨的时间为30s～60s。
[0023]在其中一些实施例中，步骤(2)和步骤(3)中所述培养温度为28℃～32℃。
[0024]本专利技术旨在提供一种快速富集与分离水生植物浮萍中的内生固氮菌的方法，与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
[0025]1、针对专利技术人发现的难以用传统方法来富集浮萍中的内生固氮菌，专利技术人从新的思路和策略提供了一种能够快速和准确的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法：基于紫萍“水生模式植物”的功能研究体系，先富集浮萍中原本种群和含量都很少的内生固氮菌，再采用梯度稀释法，并结合高通量分离、测序解析，通过测序结果是否含有杂带来判断内生固氮菌是否为单一的纯种，相比起传统的平板划线法分离纯化内生固氮菌，本专利技术的方法可以更为快速地、完全地、准确地使浮萍中的内生固氮菌得以分离；
[0026]2、本专利技术通过使用组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、使用组织表面灭菌液对浮萍进行表面灭菌后，于0.1％～1％PBS中机械研磨，过滤，得到滤液；(2)、将滤液置于固氮培养液中富集培养5天～7天，离心，弃上清，得到富集的内生固氮菌群；(3)、在96孔培养板中加入固氮培养液，按梯度分别添加步骤(2)中经富集培养的培养液，培养5天～7天得到菌液，再分别吸取菌液作为反应模板，添加至96孔PCR板，进行PCR扩增，测序；(4)、PCR测序结果无杂带的菌液，即为单一内生固氮菌；PCR测序结果有杂带的菌液，在固氮培养基上划线分离纯化至得到单一内生固氮菌。2.根据权利要求1所述的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，其特征在于，步骤(3)中所述梯度为：100μL固氮培养液中分别添加50μL、20μL、10μL、5μL、1μL和0.5μL的培养液。3.根据权利要求1所述的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增的引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。4.根据权利要求3所述的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2μL～4μL菌液、5μL细菌细胞裂解液、2μL～3μL10x PCRbuffer缓冲液、0.3mM～0.6mM MgCl2、0.1mM～0.3mM dNTPs、引物各0.5μM～1.0μM、0.3μL～0.6μL 5U/μLTaq聚合酶，加无菌ddH2O至25μL。5.根据权利要求1～4任一项所述的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄卫娟，安玉兴，孙东磊，付建涛，孔蕊，卢颖林，
申请(专利权)人：广东省科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：