一种他达那非及其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种他达那非及其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒及其制备和应用。本发明专利技术首先提供一种他达那非抗体‑乳胶微球标记物，基于该他达那非抗体‑乳胶微球标记物制备了一种乳胶微球免疫检测试剂盒，并通过优化乳胶微球抗体探针的制备，有效提高其检测实际样品的灵敏度；通过调节样品垫配方以适应液体和固体类样品的检测要求；精简样品前处理步骤，一步处理后即可完成样品前处理操作。本发明专利技术制备的检测他达那非及其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒具有简便、快速、直观、准确等优点，能够实现对样品的现场快速检测，符合市场需求，对保健食品中他达那非类药物的安全检测和初筛具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种他达那非及其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒及其制备和应用
本专利技术涉及食品药品安全检测
，具体地，涉及一种他达那非及其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒及其制备和应用。
技术介绍
他达那非，又名西力士，最早由ICOS礼来公司研发，因其与体内环PB鸟苷(cGMP)的结构相似，能有效抑制体内cGMP的特异性水解酶—5型PB二酯酶的(PDE5)的活性，减少cGMP的降解，增强阴茎勃起，可达到治疗男性阴茎勃起功能障碍(ED)的作用。因此，2003年11月经美国FDA批准，他达那非成为西地那非和伐地那非之后的第三种用于治疗男性勃起功能障碍(ED)的处方药，目前已在中国、美国、欧洲等100多个国家上市。目前，国内外针对他达那非及其类似物的检测方法有多种，包括含高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)在内的仪器分析方法、光谱法、免疫分析法、电化学方法等等。仪器方法灵敏度高，特异性强，但需要昂贵的设备、专业的操作人员和繁琐的样品前处理，不适合大量样本的快速筛查；而免疫分析方法以其快速简单、成本低、灵敏度高、适合在实际生产中现场监控及大规模样本筛查等优势，在食品中药物残留检测领域发展迅速。其中，免疫检测法目前应用最广泛的包括有酶联免疫检测法(ELISA)以及免疫层析法(LFIAs)等。免疫层析法是将免疫和色谱层析技术相结合的检测方法，以标记物标记的抗体与目标待测物特异性结合为基础并通过标记物信号实现定性或定量的目的。该方法检测时间短，使用方便，前处理简单，且不需要专业培训过的人员即可简单的操作，成本低、携带十分方便，检测效果能满足需求，适合用于食品样品的现场检测。现有针对他达那非及其类似物在食品样品中残留的免疫层析检测方法主要为胶体金、荧光微球免疫层析法，同时大多数只针对见检测单一对象，检测限较高，并且前处理步骤较复杂。比如专利CN110133259A公开了一种他达那非及其类似物的胶体金微孔法检测试剂盒，其对他达那非的最低检测限为0.2ng/mL，而且样品的前处理步骤复杂，检测时间较长。目前，针对他达那非类药物具有多样性的现状，执法部门非常有必要建立起保健食品中中他达那非类药物残留的免疫层析检测方法，以满足市场的需求。因此，建立一种快速、灵敏、准确、可靠的他达那非及其类似物的多残留免疫层析检测方法，对保健品中他达那非类药物的安全检测和初筛具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术中对他达那非的检测灵敏度不高、检测耗时长的缺陷，提供一种他达那非及其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒及其制备和应用。本专利技术的乳胶微球免疫检测试剂盒通过优化乳胶微球抗体探针的制备，有效提高其检测实际样品的灵敏度；通过调节样品垫配方以适应不同样品的检测要求，精简样品前处理步骤，一步处理即可完成样品前处理的操作。本专利技术的首要目的是提供一种他达那非抗体-乳胶微球标记物。本专利技术的另一目的是提供所述他达那非抗体-乳胶微球标记物在非诊断目的检测他达那非或制备检测他达那非的试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种他达那非和/或其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供所述的乳胶微球免疫检测试剂盒在非诊断目的检测他达那非和/或他达那非类似物中的应用。本专利技术的再一目的是提供一种非诊断目的检测他达那非和/或他达那非类似物的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种他达那非抗体-乳胶微球标记物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：S1.对MES缓冲溶液中的乳胶微球进行羧基活化，离心去除上清；所述MES缓冲溶液的pH为6.0～7.4，浓度为0.04～0.06M；S2.重悬步骤S1中的产物，再加入经0.5～1％w/vBSA溶液稀释为0.08～0.10mg/mL的他达那非单克隆抗体溶液进行标记；乳胶微球和他达那非单克隆抗体的用量比为(100～120μg)：(8～9.6μg)；S3.用15～30％w/vBSA溶液对步骤S2中标记后的溶液进行封闭，封闭时间为30～60min，离心去除上清；S4.重悬步骤S3中的产物，即得到他达那非抗体-乳胶微球标记物。优选地，所述乳胶微球为红色乳胶微球。优选地，步骤S1所述MES缓冲溶液的pH为6.5，浓度为0.05M。优选地，步骤S1中，所述采用EDC和NHS对MES缓冲溶液中的乳胶微球进行羧基活化。步骤S1中，红色乳胶微球：EDC：NHS的用量比为(100～120μg)：(10～12μg)：(12～15μg)。更优选地，步骤S1中，红色乳胶微球：EDC：NHS的用量比为100μg：10μg：12μg。进一步更优选地，步骤S1中，在1mLpH为6.5、0.05M的MES缓冲溶液中加入20μL5mg/mL的红色乳胶微球溶液，配制红色乳胶微球溶液；随后加入20μL0.5mg/mL的EDC溶液、24μL0.5mg/mL的NHS溶液；200rpm反应15min，随后在4℃下14000rpm，离心20min。优选地，步骤S2中，用pH为7.5～8.5，浓度为0.01～0.03M的BB缓冲液重悬。更优选地，步骤S2中，用pH为8.0，浓度为0.02M的BB缓冲液重悬。优选地，步骤S2所述BSA溶液的浓度为0.5％w/v。所述BSA溶液为BSA水溶液。优选地，步骤S2所述乳胶微球和他达那非单克隆抗体的用量比为100μg：8μg。优选地，步骤S3所述封闭时间为30min。优选地，步骤S3所述BSA溶液的浓度为20％w/vBSA.优选地，步骤S4中用pH为7.4，浓度为0.02M的PB缓冲液重悬；所述PB缓冲液还含有0.5～1％v/vTween-20、3～5％w/v蔗糖、0.5～1％BSA、0.3～0.5％w/vPVP和0.03～0.05％w/vprocline-300。更优选地，所述PB缓冲液还含有0.5％v/vTween-20、5％w/v蔗糖、0.5％BSA、0.3％w/vPVP和0.03％w/vprocline-300。以上任一所述他达那非抗体-乳胶微球标记物在非诊断目的检测他达那非或制备检测他达那非的试剂盒中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还要求保护一种他达那非和/或其类似物的乳胶微球免疫检测试剂盒，其特征在于，包括微孔板和免疫层析试纸条；所述微孔板含有乳胶微球标记探针样品孔，所述乳胶微球标记探针样品孔中含有所述的他达那非抗体-乳胶微球标记物；所述免疫层析试纸条包括样品垫、反应膜、吸水垫和底板；样品垫、反应膜、吸水垫依次相互交错固定在底板上；反应膜上设有平行的质控线和检测线，所述质控线靠近吸水垫端，并包被有羊抗鼠IgG，所述检测线靠近样品垫端，并包被有结构如式(Ⅱ)所示的他达那非抗原：优选地，所述微孔板为酶标微孔板。优选地，所述乳胶微球标记探针样品孔为酶标孔。优选地，所述结合垫为玻璃纤维膜。优选地，所述反应膜为NC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种他达那非抗体-乳胶微球标记物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：/nS1.对MES缓冲溶液中的乳胶微球进行羧基活化，离心去除上清；所述MES缓冲溶液的pH为6.0～7.4，浓度为0.04～0.06M；/nS2.重悬步骤S1中的产物，再加入经0.5～1％w/v BSA溶液稀释为0.08～0.10mg/mL的他达那非单克隆抗体溶液进行标记；乳胶微球和他达那非单克隆抗体的用量比为(100～120μg)：(8～9.6μg)；/nS3.用15～30％w/v BSA溶液对步骤S2中标记后的溶液进行封闭，封闭时间为30～60min，离心去除上清；/nS4.重悬步骤S3中的产物，即得到他达那非抗体-乳胶微球标记物。/n

【技术特征摘要】
1.一种他达那非抗体-乳胶微球标记物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
S1.对MES缓冲溶液中的乳胶微球进行羧基活化，离心去除上清；所述MES缓冲溶液的pH为6.0～7.4，浓度为0.04～0.06M；
S2.重悬步骤S1中的产物，再加入经0.5～1％w/vBSA溶液稀释为0.08～0.10mg/mL的他达那非单克隆抗体溶液进行标记；乳胶微球和他达那非单克隆抗体的用量比为(100～120μg)：(8～9.6μg)；
S3.用15～30％w/vBSA溶液对步骤S2中标记后的溶液进行封闭，封闭时间为30～60min，离心去除上清；
S4.重悬步骤S3中的产物，即得到他达那非抗体-乳胶微球标记物。


2.根据权利要求1所述他达那非抗体-乳胶微球标记物，其特征在于，其制备方法中，步骤S1所述MES缓冲溶液的pH为6.5，浓度为0.05M。


3.根据权利要求1所述他达那非抗体-乳胶微球标记物，其特征在于，其制备方法中，步骤S2所述BSA溶液的浓度为0.5％w/v。


4.根据权利要求1所述他达那非抗体-乳胶微球标记物，其特征在于，其制备方法中，步骤S2所述所述红色乳胶微球和他达那非单克隆抗体的用量比为100μg：8μg。


5.根据权利要求1所述他达那非抗体-乳胶微球标记物，其特征在于，其制备方法中，步骤S3所述封闭时间为30min。


6.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，程智，杨金易，王弘，徐振林，雷红涛，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44