用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及免疫检测领域，特别涉及用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板、呕吐毒素标准品、样品稀释液、生物素标记的呕吐毒素竞争抗原、酶标亲和素、洗涤液、显色液和终止液。该试剂盒相对于常规的ELISA方法，采用了亲和素与生物素偶联代替了传统的一抗与二抗的结合反应，使该检测方法的灵敏度得到了较大的提高，可以达到ppb水平；特异性强，可区分其他常见毒素，如黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮等，敏感性高，操作简便等优点，适用于大批样品的检测。

【技术实现步骤摘要】
用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及免疫检测领域，特别涉及用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒及其检测方法。
技术介绍
呕吐毒素(Vomitoxin)是近年来逐步引起人们重视的一种霉菌毒素，其分布广、危害普遍，特别是伴随着谷物的生长过程而产生，不易预防，多分布于大麦、小麦、玉米等谷物籽实中。呕吐毒素的化学名称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，属于单端孢霉烯族化合物，主要由某些镰刀菌产生，因其能引起动物呕吐，故又称呕吐毒素。在所有家畜中，猪对DON最为敏感，当饲料中的DON的含量超过0.9mg/kg时，可导致猪产生厌食、营养吸收不良、体重下降及免疫系统变化等现象。此外，DON还具有很强的致癌、致畸、致突变的毒性，已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一。目前，呕吐毒素的检测方法主要有免疫分析法和高效液相色谱法，其中免疫分析法包括酶联免疫吸附法和胶体金试纸条法，而高效液相色谱法包括同位素稀释液相色谱-串联质谱法，免疫亲和层析净化高效液相色谱法等等。基于大型精密仪器的高效液相色谱法具有灵敏度高、特异性强等优点，但需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，以及较复杂的样品预处理方法限制了此方法的广泛应用。免疫分析法是以抗原抗体特异性结合为基础而发展出来的一种检测方法，具有特异性强，敏感性高，操作简便等优点，近年来已广泛应用到毒素残留的检测中。呕吐毒素的ELISA检测试剂盒大多来自进口，而国内关于呕吐毒素的ELISA检测试剂盒的研发较少，且检测的灵敏度、特异性等有待提高。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本专利技术提供了一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒及其检测方法，该试剂盒相对于常规的ELISA方法，采用了亲和素与生物素偶联代替了传统的一抗与二抗的结合反应，使该检测方法的灵敏度得到了较大的提高，可以达到ppb水平；特异性强，可区分其他常见毒素，如黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮等，敏感性高，操作简便等优点，适用于大批样品的检测。本专利技术的技术方案如下文所示。本专利技术一方面提供了一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒，包括：包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板、呕吐毒素标准品、生物素标记的呕吐毒素竞争抗原、酶标亲和素；优选地，还包括洗涤液、显色液和终止液。根据本专利技术的一些实施方式，所述包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板的制备方法，包括如下步骤：将酶标板用所述呕吐毒素单克隆抗体包被，然后加入封闭液封闭。根据本专利技术的一些实施方式，所述呕吐毒素单克隆抗体的包被浓度2～8μg/m，优选为5μg/mL。根据本专利技术的一些实施方式，所述呕吐毒素单克隆抗体用包被液稀释到目标浓度；优选地，所述包被液可以为碳酸盐缓冲液；更优选地，所述碳酸盐缓冲液为碳酸钠和碳酸氢钠混合物。根据本专利技术的一些实施方式，将酶标板用所述呕吐毒素单克隆抗体包被时，还引入了蔗糖和PEG8000。在ELISA方法检测过程中，单克隆抗体包被浓度对试验结果影响较大，若包被浓度高，由于蛋白分子之间作用力较大而造成蛋白分子的多层化(stackingefect)，容易被洗涤，非特异性增加，若浓度太低，酶标板表面可能留下未吸附抗体，但完全封闭的活性表面，非特异性也会增加，因此必须对包被抗体蛋白浓度的进行筛选。根据本专利技术的一些实施方式，所述封闭液选自含兔血清、马血清、牛血清、胎牛血清、酪蛋白、吐温-20或吐温-80的PBS溶液；优选为含马血清和/或吐温-20的PBS溶液；更优选地，为含0.5～1％的马血清和/或0.01～0.1％吐温-20的PBS溶液。封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，抗原包被时所用的浓度较低，酶标板表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。根据本专利技术的一些实施方式，所述样品稀释液可以为含5％BSA的PBS。根据本专利技术的一些实施方式，所述呕吐毒素标准品为0～100ng/mL的梯度浓度。根据本专利技术的一些实施方式，所述生物素标记的呕吐毒素竞争抗原为生物素与呕吐毒素抗原偶联的产物。根据本专利技术的一些实施方式，所述生物素标记的呕吐毒素竞争抗原的体积稀释倍数为20000～40000倍，优选为30000倍。根据本专利技术的一些实施方式，所述酶标亲和素的体积稀释倍数为1000～3000倍，优选为2000倍；优选地，所述酶标亲和素可以为辣根过氧化物(HRP)标记的亲和素。根据本专利技术的一些实施方式，所述显色液为HRP的有色结合物；优选地，所述显色液包括底物液A和底物液B；所述底物液A为含有0.5mM的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；更优选地，底物液A和底物液B体积比为1:1。显色液的作用是与酶标亲和素的标记物结合显色，可以根据实际需要选择。根据本专利技术的一些实施方式，所述终止液为硫酸；优选地，为1.5～2.5M的硫酸。终止液的目的是终止酶促反应(或免疫学反应)的进行，可以根据实际选择的酶标记物，选择合适的终止液。根据本专利技术的一些实施方式，所述洗涤液为PBS+0.1～1％％吐温-20，pH值为7.0-7.4。本专利技术另一方面还提供了上述试剂盒检测呕吐毒素的方法，包括如下步骤：1)向包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板中加入待测样品或呕吐毒素标准品；2)加入生物素标记的呕吐毒素竞争抗原；3)加酶标亲和素；4)加入显色液；5)加入终止液；6)测吸光度OD450nm，绘制的标准曲线，计算待测样品中呕吐毒素的含量。根据本专利技术的一些是实施方式，所述待测样品为谷物或饲料。根据本专利技术的一些实施方式，所述待测样品还包括预处理步骤，所述预处理包括：将待测样品烘干后粉碎，加水混合，过滤，取上清液。根据本专利技术的一些实施方式，所述方法，包括如下步骤：1)取包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板，向酶标孔中加入待测样品或呕吐毒素标准品，室温孵育；2)随后再加入生物素标记的呕吐毒素竞争抗原，室温孵育，倒掉孔中溶液，用稀释后的洗涤液洗板，拍板；3)向酶标孔中加入酶标亲和素，室温孵育，洗板，最后一次洗板时，室温孵育后再拍板；4)将底物液A和底物液B混合后，加入酶标孔中，室温避光显色；5)每孔加入终止液，轻轻振荡混匀，测定每孔的吸光度(波长为450nm)；6)以呕吐毒素标准品测试的吸光度值与标准品浓度的对数值绘制标准曲线，对照标准曲线，根据待测样品的吸光度值，计算样品中呕吐毒素的含量。根据本专利技术的一些实施方式，步骤(4)中，将底物液A和底物液B1：1混合后，加入酶标孔中，室温避光显色。本专利技术另一方面还提供了上述试剂盒用于检测谷物、饲料中呕吐毒素含量的用途。本专利技术的有益效果：呕吐毒素试剂盒的研发难本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒，其特征在于，包括：包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板、呕吐毒素标准品、生物素标记的呕吐毒素竞争抗原、酶标亲和素；优选地，还包括洗涤液、显色液和终止液。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒，其特征在于，包括：包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板、呕吐毒素标准品、生物素标记的呕吐毒素竞争抗原、酶标亲和素；优选地，还包括洗涤液、显色液和终止液。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有呕吐毒素单克隆抗体的酶标板的制备方法，包括如下步骤：将酶标板用所述呕吐毒素单克隆抗体包被，然后加入封闭液封闭；优选地，所述呕吐毒素单克隆抗体的包被浓度为2～8μg/mL；优选地，所述封闭液选自含兔血清、马血清、牛血清、胎牛血清、酪蛋白、吐温-20或吐温-80的PBS溶液；优选为含马血清和/或吐温-20的PBS溶液。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的呕吐毒素竞争抗原的体积稀释倍数为20000～40000倍，优选为30000倍。


4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标亲和素的体积稀释倍数为1000～3000倍，优选为2000倍；优选地，所述酶标亲和素为辣根过氧化物标记的亲和素。


5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液为HRP的有色结合物；优选地，所述显色液包括底物液A和底物液B；所述底物液A为含有0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳旭，王旭，郭思桃，王永强，
申请(专利权)人：清远海贝生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44