用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，所述试剂包括如下引物对和探针：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A；由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B；由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C。本发明专利技术PCR检测试剂可实现在一管中同时检测幽门螺旋杆菌和两个耐药基因(10个突变位点)及一管内参基因，有效改善多对引物和探针之间的干扰，有效提高了检测灵敏度和特异性，为临床治疗幽门螺旋杆菌耐药基因的检测提供快速、高效的方法。

【技术实现步骤摘要】
用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂及其应用
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂及其应用。
技术介绍
目前，对幽门螺旋杆菌耐药检测的方法有很多种，有条件的医院可以开展体外药敏试验，该方法通过在不同种类的抗生素环境下幽门螺旋杆菌的培养情况来确定其最低抑菌浓度，从而判断是否对所测试抗生素具有耐药性。但是该方法有以下几个缺点：1)幽门螺旋杆菌培养要求条件较高，培养成功率低；2)培养耗时长。没有条件开展体外药敏试验的采用分子生物学的检测方式，现有的分子生物学检测幽门螺旋杆菌耐药突变的方法主要有：PCR-熔解曲线法、PCR-扩增线法、测序法、飞行时间质谱法、基因芯片(PCR-反向点杂交)等。中国专利技术专利申请CN111850154A为例采用的是PCR-熔解曲线法，通过熔解曲线峰值的Tm值来判定阴阳性，但该方法对于某些单碱基突变峰值很接近不容易区分野生型和突变型，并且检测时间比扩增曲线法耗时长，另外该方法对检测仪器的温控分辨率选择性较高，无法应用于目前临床主流的荧光PCR仪。目前研究明确与耐药表型正相关的抗生素只有两种克拉霉素和左氧氟沙星，过多的抗生素耐药基因检测只能作为基础研究用，不可能应用到临床诊断，容易给医生造成误导，另外该方法操作复杂，涉及到测序，整个流程耗时长，测序仪价格昂贵，对人员专业要求较高，很难在临床诊断上推行。综上，现有的检测方法多重荧光PCR法因引物和探针相互竞争会导致多重PCR的扩增效率降低，影响检测灵敏度，检出率低和扩增效率低的缺陷，亟待进一步改进。
技术实现思路
为此，本专利技术提供一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂及其应用。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术实施例提供一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，所述试剂包括如下引物对和探针：由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A；由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B；由SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C；由SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的两个单链DNA组成的引物对D；以及与所述引物对A配合的探针A，所述探针A的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；与所述引物B配合的探针B1、探针B2、探针B3，所述探针B1的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，所述探针B2的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述探针B3的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；与所述引物C配合的探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7，所述探针C1的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，所述探针C2的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，所述探针C3的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，所述探针C4的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，所述探针C5的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，所述探针C6的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，所述探针C7的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示；与所述引物D配合的探针D，所述探针D的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示。优选地，所述探针A的5′端标记有报告荧光染料CY5，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ3；所述探针B1、探针B2、探针B3的5′端标记有报告荧光染料FAM，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；所述探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7的5′端标记有报告荧光染料VIC，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；所述探针D的5′端标记有报告荧光染料ROX，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ2。优选地，所述多重荧光PCR试剂还包括Megabuffer、5％甘油，dN(U)TPMix、3mMMgCl2、MegaTaqDNA聚合酶、UDG酶、BSA、Betaine、蔗糖。优选地，所述BSA的浓度为0.3mg/ml、Betaine的浓度1.5M、蔗糖的浓度为2w/v％。优选地，所述引物对A中每个引物、所述引物对B中每个引物、所述引物对C中每个引、所述引物对D中每个引物的摩尔比为(1-2)：(1-2)：(1-3)：(1-2)；所述探针A、探针B1、探针B2、探针B3、探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7、探针D摩尔比为5:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:5。优选地，所述引物对A中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；所述引物对B中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；所述引物对C中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.3μM；所述引物对D中每个引物的在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；所述探针A在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2μM；所述探针B1、探针B2、探针B3在多重荧光PCR试剂中的浓度分别为0.04μM；所述探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7在多重荧光PCR试剂中的浓度分别为0.04μM；所述探针D在多重荧光PCR试剂中的浓度为0.2Mm。本专利技术还提供用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂盒，其包括上述所述的多重荧光PCR试剂。上述所述试剂在制备同时检测待测样品中是否含有幽门螺旋杆菌及具耐克拉霉素和左氧氟沙星耐药性基因多个突变位点的幽门螺旋杆菌的产品中的应用，也属于本专利技术的保护范围优选地，所述同时检测为用权利要求1所述的试剂或权利要求7所述的试剂对所述待测样品进行多重荧光PCR反应。本专利技术具有如下优点：本专利技术用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，使用MGB探针对各个突变型靶标进行结合，根据荧光信号的强弱区分野生和突变型，通过添加并调试多重PCR扩增体系中的促进剂，改善多重PCR体系的扩增效果。本专利技术PCR检测试剂可实现在一管中同时检测幽门螺旋杆菌和两个耐药基因(10个突变位点)及一管内参基因，有效改善多对引物和探针之间的干扰，有效提高了检测灵敏度和特异性，为临床治疗幽门螺旋杆菌耐药基因的检测提供快速、高效的方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。图1为本专利技术实施例提供的多重荧光PCR检测试剂检测幽门螺旋杆菌基因组(ATCC43504)的CY5荧光扩增信号；图2为本专利技术实施例提供的的多重荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，所述试剂包括如下引物对和探针：/n由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A；/n由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B；/n由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C；/n由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两个单链DNA组成的引物对D；/n以及与所述引物对A配合的探针A，所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；/n与所述引物B配合的探针B1、探针B2、探针B3，所述探针B1的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，所述探针B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述探针B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；/n与所述引物C配合的探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7，所述探针C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述探针C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述探针C3的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述探针C4的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述探针C5的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述探针C6的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示，所述探针C7的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；/n与所述引物D配合的探针D，所述探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，所述试剂包括如下引物对和探针：
由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A；
由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B；
由SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C；
由SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的两个单链DNA组成的引物对D；
以及与所述引物对A配合的探针A，所述探针A的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；
与所述引物B配合的探针B1、探针B2、探针B3，所述探针B1的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，所述探针B2的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述探针B3的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
与所述引物C配合的探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7，所述探针C1的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，所述探针C2的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，所述探针C3的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，所述探针C4的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，所述探针C5的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，所述探针C6的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，所述探针C7的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示；
与所述引物D配合的探针D，所述探针D的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示。


2.如权利要求1所述的用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，
所述探针A的5′端标记有报告荧光染料CY5，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ3；
所述探针B1、探针B2、探针B3的5′端标记有报告荧光染料FAM，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；
所述探针C1、探针C2、探针C3、探针C4、探针C5、探针C6、探针C7的5′端标记有报告荧光染料VIC，3′端标记有猝灭荧光染料MGB；
所述探针D的5′端标记有报告荧光染料ROX，3′端标记有猝灭荧光染料BHQ2。


3.如权利要求1所述的用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂，其特征在于，
所述多重荧光PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐洪涛，屈彬彬，许俊泉，李茜，
申请(专利权)人：格物致和生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11