基于虚拟分割方法的蛋白靶分子数字化定量检测方法技术

本发明专利技术提供一种基于虚拟分割方法的蛋白靶分子数字化定量检测方法，所述方法包括将待测蛋白靶分子溶液加入到反应位中，所述反应位具有平的底面并且所述底面固定有与所述待测蛋白靶分子产生抗原抗体反应的蛋白分子，固定到所述底面的待测蛋白靶分子与中介配体结合，所述中介配体的作用是催化液相-固相原位发光反应；将液相-固相原位发光反应液滴加到所述反应位中，反应生成的发光分子共价连接到所述底面上；和获得反应后所述平面底面的数字图片，然后采用虚拟分割方法，实现所述待测蛋白靶分子的数字化定量检测。本发明专利技术整个方法所要求的检测系统大大简化，检测耗材和检测系统成本大大降低，大大拓宽了数字定量技术应用。基于本发明专利技术方法，可以实现可靠、灵敏、快速，并且价格低廉的数字化检测。价格低廉的数字化检测。

【技术实现步骤摘要】
基于虚拟分割方法的蛋白靶分子数字化定量检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及基于虚拟分割方法的蛋白靶分子数字化定量检测方法。

技术介绍

[0002]体外诊断技术(In Vitro Diagnosis，IVD)是在人体之外，通过对人体的样品(血液、体液、组织等)进行样品处理、生化反应以及结果检测，从而获得临床诊断信息的技术。体外诊断技术的检测对象是液体，常规检测体积1～100ml。液体中的生物、化学物质主要是核酸分子(DNA/RNA)，蛋白分子。体外诊断检测的主要人体样品是血液。由于正常人体生物、化学物质在血液中的浓度相对恒定，特定生物、化学物质的浓度变化，可以表征人体是否处于健康状态。体外诊断过程可以分为以下三个阶段。
[0003](一)样品处理
[0004]人体样品，尤其是血液，含有多种生物、化学物质，例如DNA/蛋白靶分子。需要对样品进行处理，对待检测的靶分子进行富集、纯化，从而减少人体样品中其余物质对生化反应和结果检测的干扰。
[0005](二)生化反应
[0006]体外诊断中，经过处理和捕获的靶分子一般浓度较低。需要经过配体放大反应，增大靶分子物质量或者表征靶分子的物质量。例如，常用的DNA靶分子配体放大反应是PCR反应，通过反应增大待测DNA分子的物质总量；常用的蛋白靶分子配体放大反应是ELISA(酶联促发反应)，通过反应生成大量化学发光分子用于表征蛋白靶分子，增大蛋白靶分子的检测信号。
[0007](三)结果检测
[0008]常规生物、化学检测技术基于光学检测。经过配体放大反应后，较高浓度的核酸、蛋白光学标记物(例如荧光基团、化学发光物质)通过光学器件检测，例如光电倍增管(PMT)或者CCD/CMOS成像光学器件。
[0009]常规蛋白靶分子的检测方法是酶联免疫吸附实验(ELISA)。ELISA有多种类型，其中一种典型的ELISA方法是从将目标抗原(蛋白靶分子)固定在一个固体表面开始。这通常用一块能够被动结合蛋白的96孔或384孔板完成。通过偶联某种酶来制备相应抗体。添加这种偶联物到样品中即可让抗体结合抗原。对目标抗原不具特异性的结合物质随后用洗涤步骤去除。然后，添加酶的底物，以让溶液中的底物与连接抗体的酶发生反应，最终产生颜色、荧光或化学发光变化，读取这种变化即可测定每份样品中蛋白靶分子的数量。ELISA检测方法有很多，但在实验室中最普遍的方法是比色、荧光和化学发光法。
[0010]ELISA方法可以分为三大类：定量、半定量和定性检测方法。定量ELISA方法的缺陷是：
[0011](1)相对定量。需要使用标准品，以解释实验样品的结果。生成标准曲线(通常借助梯度稀释且浓度已知的某种分析物或其他标准品)。将样品的读取值与标准曲线进行比较，
并确定绝对定量的分析物浓度。
[0012](2)一致性差。由于待测样品与标准样品、不同待测样品之间的ELISA反应效率有可能不一致，由此导致其定量分析所依赖的相对值不是恒定不变。另外，待测样品的反应体系与靶分子有竞争性作用，反应体系中的抑制物对生化反应效率也有影响。
[0013]这两大技术瓶颈造成了ELISA技术的结果在实验室内部与实验室之间的偏差，甚至不同实验室得到的结果和结论相互矛盾。尤其在低浓度蛋白靶分子条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。
[0014]针对人体样品(尤其是血液)中痕量蛋白靶分子的可靠、灵敏、快速检测，是目前精准医学的重大需求。其中，数字化检测技术是目前的重点研发技术。数字化检测的核心过程是将待测样品均匀分配到大量的反应单元中，这些反应单元同时进行生化反应并进行结果检测。以针对核酸分子检测的数字PCR技术为例，策略是：将一个待测样品均匀分配到大量微小的反应单元中；然后，这些微小的反应单元同时进行PCR扩增反应，实现单拷贝或者多拷贝靶序列分子PCR扩增；扩增后，对每个反应单元检测到的荧光信号设定一个阈值，高于阈值时荧光信号的反应单元判读为1(“阳性”)，低于阈值时荧光信号的反应单元判读为0(“阴性”)。理论上讲，每个反应单元中靶序列分子(DNA模板)的分配存在三种可能性：零拷贝、一个拷贝或多个拷贝。当反应单元的数目足够大，大部分反应单元的内部只含有一个拷贝或者零拷贝靶序列分子(近似于泊松分布)，从而实现单拷贝靶序列分子PCR扩增。最后，通过统计阳性和阴性两种信号类型的反应单元比例和数目，并进行泊松统计学分析，最终计算出原始待测样本中的靶序列拷贝数。
[0015]以针对蛋白检测的数字ELISA技术为例，策略是：通过磁珠在样品中捕获待测蛋白靶分子。捕获到蛋白的磁珠被分配到与其尺寸接近的微坑阵列中，每个微坑只能容纳一个磁珠，每个微坑被氟化油单独隔离。然后，每个微坑进行ELISA反应。反应后，对每个反应单元检测到的发光信号设定一个阈值，高于阈值时发光信号的反应单元判读为1(“阳性”)，低于阈值时发光信号的反应单元判读为0(“阴性”)。理论上讲，每个磁珠捕获蛋白靶分子存在三种可能性：零分子、单分子或者多分子。当磁珠的数目足够大，大部分磁珠只捕获一个蛋白靶分子或者零蛋白靶分子；最终，大部分反应单元的内部只含有一个分子或者零分子，从而实现单分子光学信号放大。最后，通过统计阳性和阴性两种信号类型的反应单元比例和数目，并进行泊松统计学分析，最终计算出原始待测样本中的蛋白靶分子数目。
[0016]数字化检测的核心概念是：
[0017](1)反应单元之间相互独立。每个反应单元内的生化反应不与其他反应单元的生化反应“串扰”。以针对核酸检测的数字PCR技术为例，两个反应单元内的PCR反应不能相互“串扰”；以针对蛋白检测的数字ELISA技术为例，两个反应单元内的ELISA反应不能相互“串扰”。
[0018](2)反应单元空间尺寸均一，分布随机性。待测样品分布到每个反应单元的概率一样，为结果检测的精准分析奠定基础。
[0019](3)反应单元数目远远高于待检测的DNA/蛋白靶分子。从而，低浓度靶分子进入反应单元符合泊松分布，为结果检测的数据分析奠定理论基础。
[0020]反应单元不相互独立、反应单元空间尺寸不均一以及反应单元数目过低，都会对下游的结果检测产生误差。
[0021]数字化检测技术的优点是：
[0022](1)绝对定量。可以直接计算靶分子的绝对数目，无需依赖于对照标准样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。
[0023](2)灵敏度高。可在物理层面实现单分子级检测。对每个反应单元的反应结果判读仅判断有/无两种状态。高于阈值时荧光信号的反应单元判读为1(“阳性”)，低于阈值时荧光信号的反应单元判读为0(“阴性”)。
[0024](3)准确度高。待测样品的反应体系分配过程可以极大降低与靶分子有竞争性作用的背景物质浓度，对生化反应抑制物的耐受能力也大大提高，因此数字化检测技术非常适合在复杂背景中检测痕量DNA/蛋白靶分子。
[0025]现有数字化检测技术的不足是：
[0026](1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于虚拟分割方法的蛋白靶分子数字化定量检测方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：待测蛋白靶分子溶液加入到反应位中，所述反应位具有平的底面并且所述底面固定有与所述待测蛋白靶分子产生抗原抗体反应的蛋白分子，反应时，所述待测蛋白靶分子随机分布到所述底面；步骤2：固定到所述底面的待测蛋白靶分子与中介配体结合，所述中介配体的作用是催化液相-固相原位发光反应；步骤3：将液相-固相原位发光反应液滴加到所述反应位中，在所述底面上进行所述液相-固相原位发光反应，该反应对待测蛋白靶分子进行光学放大，在所述待测蛋白靶分子周边形成固相发光区域；并且所述底面事先修饰与所述液相-固相原位发光反应生成的发光分子结合的功能基团，使得反应生成的发光分子共价连接到所述底面上；和步骤4：获得反应后所述平面底面的数字图片，然后采用虚拟分割方法，实现所述待测蛋白靶分子的数字化定量检测。2.根据权利要求1所述的蛋白靶分子数字化定量检测方法，其特征在于，所述待测蛋白靶分子溶液是来自血清、血浆、组织匀浆或细胞提取液的上清液。3.根据权利要求1所述的蛋白靶分子数字化定量检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：荆高山，王栋，许俊泉，
申请(专利权)人：格物致和生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：