【技术实现步骤摘要】
本公开涉及分子生物学领域，更具体涉及一种改进的检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、在多种生物样品(例如血清、血浆、体液等)或细胞裂解液中，对微量分析物(例如蛋白分子)的检测对于预测多种疾病的发生发展、提高临床诊断的准确率、研究疾病发生发展机制十分重要。
2、夹心酶联免疫吸附反应(elisa)是蛋白快速准确定量的金标准之一。捕获抗体对目标蛋白的富集，以及通过检测抗体的信号放大，使夹心酶联免疫吸附反应能够快速、准确、低背景地定量目标蛋白。该方法的主要缺点在于它的检测限在纳克每毫升水平，不能检测低浓度的蛋白。例如，早期癌症、阿尔兹海默检测等需要以fg/ml浓度有效检测分析物，这超出了elisa免疫测定技术的能力范围。同时，对于传统的夹心酶联免疫吸附反应，一个反应体系只能检测一种蛋白；如果需要检测多种蛋白，则需要设置多个反应孔，这大大增加了样品用量，因而增加了实验工作量和检测成本。
3、2002年，邻位连接技术(pla)由于高灵敏、高特异性而得到广泛关注，其是对传统免疫方法的重要补充。邻位连接技术是将待检测物同时用2种标记有核酸序列的抗体识别，当这些抗体与目标待检测物结合后，修饰的核酸序列被固定在邻位，这些核酸序列在核酸连接酶的作用下连接，连接后的核酸序列作为模板进行后续的核酸扩增。简而言之，邻位连接技术通过多种抗体的识别获得高特异性，并通过核酸扩增获得高灵敏性。邻近连接测定的方法不同于其他基于抗原抗体反应的原位杂交应用，因为其使用两种抗体(而不是单个抗体)识别相同蛋白的不同表位从而增加了蛋白特异性。此外，使用两种
4、传统邻位连接技术包括均相邻位连接技术(也称为液相邻位连接技术)和固相邻位连接技术。均相/液相邻位连接技术步骤简单，所有实验步骤都在同一溶液中进行。然而，由于缺乏洗涤步骤，导致均相/液相邻位连接技术背景相对较高；同时由于核酸连接酶在复杂生物样品(包括血清或血浆)中容易失去活性，因此影响反应效率、导致灵敏度降低。固相邻位连接技术，例如核酸连接的免疫-夹心测定(nulisa)技术，采用两种磁珠、两种捕获序列，分别捕获“抗原-抗体”复合物；洗涤步骤减低了背景干扰，后续用于qpcr或二代测序，可以实现蛋白的单检/共检。然而，此方法需要两种类型磁珠、两种捕获序列，实验成本较高；同时，在反应的大部分时间，所有“抗原-抗体”复合物被捕获在磁珠表面，在待检蛋白浓度很高或多种蛋白共检测时，容易发生抗体偶联序列的非正确连接，降低有用数据的占比。
5、因此，本领域亟需发展一种简单快速、灵敏度高、特异性强且稳定性高的定量方法来检测低丰度蛋白、修饰蛋白或蛋白复合体。
技术实现思路
1、在第一方面，本公开提供了一种检测方法，其依次包括如下步骤：
2、(1)将与第一探针偶联的第一抗体、与第二探针偶联的第二抗体和待测样品在溶液中混合，使得第一抗体和第二抗体结合至待测样品中的分析物，形成免疫复合物；
3、(2)使固体表面与步骤(1)的溶液接触，将所述免疫复合物捕获至所述固体表面；
4、(3)清洗所述固体表面一次以上，去除未结合到固体表面上的分子；
5、(4)洗脱，将结合在所述固体表面上的免疫复合物释放到第一洗脱缓冲液中；
6、(5)将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中，或者将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中，加入连接体系，使免疫复合物发生邻位连接反应，并可选地对邻位连接反应产物进行纯化；以及
7、(6)检测，获得待测样品中的分析物的检测结果；
8、优选地，所述方法在步骤(5)和(6)之间还包括如下步骤：
9、(5'-1)二次捕获及清洗：将免疫复合物再次捕获至固体表面，清洗所述固体表面一次以上，去除固体表面上未结合的分子；
10、(5'-2)洗脱，将结合在所述固体表面上的免疫复合物释放到第二洗脱缓冲液中。
11、优选地，在步骤(6)中，所述检测包括多重荧光定量pcr或二代测序，可选地对pcr扩增产物进行纯化。
12、在本文中，固体表面与溶液接触包括固体被完全浸没在溶液中、固体被溶液包围、固体的一个以上表面与溶液接触、固体的一个以上表面被溶液浸没等情况。
13、在一些实施方式中，在步骤(5)中，将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中，或者将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中，其中，所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液与所述固体(例如磁珠)表面接触，例如，所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液与所述固体(例如磁珠)在同一容器中。
14、在一些实施方式中，在步骤(5)中，将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中，或者将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中，其中，所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液不与所述固体(例如磁珠)表面接触，例如，将所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液置于与所述固体(例如磁珠)不同的容器中。
15、在一些实施方式中，在步骤(5)中，将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中可以是将免疫复合物继续保持在步骤(4)的第一洗脱缓冲液中，也可以置换为新的第一洗脱缓冲液。
16、在一些实施方式中，在步骤(5)中，向第一洗脱缓冲液中加入连接体系，进行连接反应。
17、在一些实施方式中，在步骤(5)中，向与第一洗脱缓冲液不同的其他溶液中加入连接体系，进行连接反应。
18、在本文中，与第一洗脱缓冲液不同的其他溶液可以是任何与连接反应兼容的溶液，例如，其可以选自te缓冲液、tris、hepes、bis-tris和mops中的一种以上，优选地，所述与第一洗脱缓冲液不同的其他溶液的阳离子浓度为1mm至100mm，例如，1mm至5mm、5mm至10mm、1mm至10mm、5mm至20mm、5mm至30mm、10mm至30mm、10mm至50mm、10mm至60mm、10mm至80mm、20mm至40mm、20mm至50mm、20mm至60mm、20mm至80mm、30mm至50mm、30mm至70mm、40mm至60mm、40mm至80mm或50mm至100mm；优选地，所述阳离子为钠离子。
19、在一些实施方式中，清洗所述固体表面一次以上包括清洗1-5次、1-4次、1-3次，例如，1次、2次、3次、4次和/或5次。
20、在一些实施方式中，步骤(2)至(4)可以重复进行2次、3次、4次或5次。
【技术保护点】
1.一种检测方法，其依次包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法在步骤(5)和(6)之间还包括如下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(6)中，所述检测包括多重荧光定量PCR或二代测序。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一抗体、第二抗体、第一探针和/或第二探针具有停泊基团，所述固体表面具有捕获基团，所述停泊基团与所述捕获基团结合，由此将免疫复合物捕获至固体表面；优选地，所述停泊基团选自生物素、polydT、polydA中的一种以上，所述捕获基团选自链霉亲和素、抗生物素蛋白、polydT、polydA中的一种以上。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，使用捕获序列将免疫复合物捕获至所述固体表面，所述捕获序列与第一探针和/或第二探针的捕获区域互补，所述捕获序列具有停泊基团，所述固体表面具有捕获基团，所述停泊基团与所述捕获基团结合，由此将免疫复合物捕获至固体表面；优选地，所述停泊基团选自生物素、polydT、polydA中的一种以上，所述捕获基团选自链霉亲和素抗生物素蛋白、polydT、
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)和/或步骤(2)中，所述溶液为结合缓冲液，所述结合缓冲液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上，优选地，所述结合缓冲液的阳离子浓度为100mM至1M；优选地，所述阳离子为钠离子；和/或，在步骤(3)和(5'-1)中，使用清洗溶液进行清洗，所述清洗溶液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上，优选地，所述清洗溶液的阳离子浓度为10mM至200mM，优选地，所述阳离子为钠离子。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一洗脱缓冲液选自TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上，优选地，所述第一洗脱缓冲液的阳离子浓度为1mM至100mM，优选地，所述阳离子为钠离子；和/或，第二洗脱缓冲液选自DEPC水、无RNA酶/DNA酶的水、TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述连接体系包括夹板序列和连接酶；优选地，所述连接酶选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一探针和第二探针各自独立地包含寡核苷酸链和与抗体偶联的基团，所述寡核苷酸链包含二代测序接头区域、条形码区域和夹板序列互补区域；优选地，所述与抗体偶联的基团选自叠氮基团、氨基和巯基中的一种以上，优选地，所述与抗体偶联的基团位于第一探针和/或第二探针的5’末端或3’末端。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，第一探针和/或第二探针的寡核苷酸链还包含UMI区域和/或捕获区域。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，邻位连接反应产物为核酸报告分子，所述核酸报告分子包含第一探针和第二探针的UMI区域、条形码区域和/或夹板序列互补区域。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述固体选自磁性固体例如磁珠和微量滴定孔板。
13.一种用于权利要求1-12中任一项所述的方法的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，第一探针和第二探针各自独立地包含寡核苷酸链和与抗体偶联的基团，所述寡核苷酸链包含二代测序接头区域、条形码区域和夹板序列互补区域；优选地，所述与抗体偶联的基团选自叠氮基团、氨基和巯基中的一种以上，优选地，所述与抗体偶联的基团位于第一探针和/或第二探针的5’末端或3’末端。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其中，第一探针和/或第二探针的寡核苷酸链还包含UMI区域和/或捕获区域。
...【技术特征摘要】
1.一种检测方法，其依次包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法在步骤(5)和(6)之间还包括如下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(6)中，所述检测包括多重荧光定量pcr或二代测序。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一抗体、第二抗体、第一探针和/或第二探针具有停泊基团，所述固体表面具有捕获基团，所述停泊基团与所述捕获基团结合，由此将免疫复合物捕获至固体表面；优选地，所述停泊基团选自生物素、polydt、polyda中的一种以上，所述捕获基团选自链霉亲和素、抗生物素蛋白、polydt、polyda中的一种以上。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，使用捕获序列将免疫复合物捕获至所述固体表面，所述捕获序列与第一探针和/或第二探针的捕获区域互补，所述捕获序列具有停泊基团，所述固体表面具有捕获基团，所述停泊基团与所述捕获基团结合，由此将免疫复合物捕获至固体表面；优选地，所述停泊基团选自生物素、polydt、polyda中的一种以上，所述捕获基团选自链霉亲和素抗生物素蛋白、polydt、polyda中的一种以上。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)和/或步骤(2)中，所述溶液为结合缓冲液，所述结合缓冲液选自ssc缓冲液、tris、hepes、bis-tris和mops中的一种以上，优选地，所述结合缓冲液的阳离子浓度为100mm至1m；优选地，所述阳离子为钠离子；和/或，在步骤(3)和(5'-1)中，使用清洗溶液进行清洗，所述清洗溶液选自ssc缓冲液、tris、hepes、bis-tris和mops中的一种以上，优选地，所述清洗溶液的阳离子浓度为10mm至200mm，优选地，所述阳离子为钠离子。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一洗脱缓冲液选自te缓冲液、tris、hepes、bis-tris和mops中的一种以...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵伟，贾蕊，田雨，许俊泉，
申请(专利权)人：格物致和生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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