【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物检测领域，尤其涉及一种检测方法和试剂盒。
技术介绍
1、酶联免疫吸附反应(elisa)是经典的蛋白定性和定量检测方法，但其检测限仅在ng/ml水平，不能满足超微量生物分子的检测需求。邻位连接技术(proximity ligationassay，pla)是一项蛋白质体外检测技术，其检测灵敏度能够达到elisa的1000倍。该技术采用核酸适体或单/多克隆抗体-寡聚核苷酸复合物作为邻位连接探针，当两个邻位探针同时识别一个目标蛋白分子时，邻位探针上的寡聚核苷酸在空间上相互接近，产生所谓的邻近效应(proximity)，在特定的连接寡聚脱氧核苷酸(connector oligonucleotides)和连接酶的作用下，两个邻位探针上的寡聚核苷酸彼此连接，形成新的寡聚核苷酸链，使用特定的引物和探针对该寡聚核苷酸链进行实时荧光定量pcr检测，从而将对蛋白质的检测转变成为对核酸的检测，实现痕量蛋白的分析。
2、固相pla技术是pla技术的一种，该技术主要基于微球和试管。固相pla反应体系中的游离探针以及非游离探针之间的非特异性结合会导致背景信号增高，影响pla反应的检测灵敏度。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，降低固相pla技术检测过程中的背景信号，进一步提高其检测灵敏度，本专利技术提供一种方法，其通过使用与捕获探针结合的阻断剂来降低pla技术的背景信号，提高检测灵敏度。
2、具体地，本公开提供了一种检测方法，所述方法包括：
3、1)将第一
4、2)加入阻断剂和包含分析物的待测样品，所述阻断剂用于封闭捕获探针，所述第一结合产物中的第一邻位探针与待测样品中的分析物结合，由此获得第二结合产物；
5、3)加入第二邻位探针，使得所述第二邻位探针与所述第二结合产物结合，其中所述第二邻位探针包含第二核苷酸部分和用于结合待测样品中的分析物的第二结合部分，所述第二结合部分和所述第一结合部分与同一分析物结合形成免疫复合物；
6、4)使所述第一邻位探针的第一核苷酸部分和所述第二邻位探针的第二核苷酸部分相互作用从而产生核酸报告分子；
7、5)检测所述核酸报告分子。
8、在某些实施方式中，所述阻断剂包含寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸组成；优选地，在所述阻断剂与所述捕获探针结合后，所述捕获探针的3’端和/或5’端暴露的连续核苷酸的数量为7个以下，优选地，5个以下。
9、在某些实施方式中，所述阻断剂为寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的至少15-35个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的15-35个连续核苷酸组成。
10、在某些实施方式中，所述寡聚核苷酸序列包含腺嘌呤脱氧核糖核苷酸a、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸g、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸c和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸t；优选地，所述寡聚核苷酸序列中的一个以上胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸t被替换为尿嘧啶脱氧核糖核苷酸u。
11、在某些实施方式中，所述寡聚核苷酸序列的3’端具有阻断所述寡聚核苷酸序列延伸的修饰；优选地，所述修饰为双脱氧胞苷ddc修饰。
12、在某些实施方式中，所述阻断剂与所述捕获探针的浓度比为1:1至5:1。
13、在某些实施方式中，在所述步骤1)和所述步骤2)之间、所述步骤2)和所述步骤3)之间、所述步骤3)和所述步骤4)之间和/或所述步骤4)和所述步骤5)之间，还包括洗涤步骤；优选地，所述洗涤步骤为洗涤2-4次；优选地，所述洗涤步骤所使用的洗涤缓冲液为：0.05％tween 20，1×pbs，ph 7.0。
14、在某些实施方式中，所述分析物包含蛋白质。
15、在某些实施方式中，所述固相基质具有与所述捕获探针结合的修饰基团a；优选地，所述固相基质为磁珠；优选地，所述修饰基团a为oligo-dt或链霉亲和素。
16、在某些实施方式中，所述捕获探针为一条以上单链dna，所述捕获探针具有与所述修饰基团a结合的修饰基团b，所述捕获探针与所述第一邻位探针的所述第一核苷酸部分互补杂交；优选地，所述修饰基团b为poly a或生物素；优选地，所述捕获探针为一条单链dna，所述单链dna由15-35个核苷酸组成。
17、在某些实施方式中，所述第一结合部分和所述第二结合部分各自为核酸适体、抗体或抗体的抗原结合片段，所述第一核苷酸部分和所述第二核苷酸部分各自为一条以上单链dna，所述第一核苷酸部分的一条以上单链dna包含与捕获探针互补杂交的核苷酸序列；优选地，所述一条以上单链dna的长度为30-100个核苷酸；优选地，所述一条以上单链dna中的每一条的一个末端具有选自巯基、氨基、叠氮基的修饰基团c，所述修饰基团c与偶联剂反应以将所述第一核苷酸部分的一条以上单链dna与所述第一结合部分偶联、将所述第二核苷酸部分的一条以上单链dna与所述第二结合部分偶联；优选地，所述偶联剂选自emcs、sulfo-smcc、sulfo-lc-spdp或smpb中的一种以上；优选地，所述第一结合部分和所述第二结合部分分别结合同一分析物的不同表位。
18、在某些实施方式中，所述免疫复合物由所述第一邻位探针、所述第二邻位探针和所述分析物组成。
19、在某些实施方式中，所述步骤4)中，加入连接寡聚核苷酸和连接酶，使所述第一核苷酸部分的游离末端与所述第二核苷酸部分的游离末端连接形成所述核酸报告分子；优选地，所述连接酶选自t4 dna连接酶、t7 dna连接酶、splintr连接酶、taq连接酶。
20、在某些实施方式中，所述检测采用qpcr检测；优选地，在所述qpcr检测之前或在所述qpcr检测过程中加入ung酶以降解所述阻断剂。
21、在某些实施方式中，在所述步骤4)和所述步骤5)之间还包括洗脱步骤使所述免疫复合物与所述固相基质脱离；优选地，所述洗脱步骤包括加入无酶无菌水，在70℃-95℃下孵育10-20分钟。
22、另一方面，本公开还提供了用于本公开的方法的阻断剂，所述阻断剂用于封闭捕获探针。
23、在某些实施方式中，所述阻断剂包含寡聚核苷酸序列，寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸组成；优选地，在所述阻断剂与所述捕获探针结合后，所述捕获探针的3’端和/或5’端暴露的连续核苷酸的数量为7个以下，优选地，5个以下。
24、在某些实施方式中，所述阻断剂为寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的15-35个本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测方法，所述方法依次包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阻断剂包含寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸组成；优选地，在所述阻断剂与所述捕获探针结合后，所述捕获探针的3’端和/或5’端暴露的连续核苷酸的数量为7个以下，优选地，5个以下。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述阻断剂为寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的15-35个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的15-35个连续核苷酸组成。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述寡聚核苷酸序列包含腺嘌呤脱氧核糖核苷酸A、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸G、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T；优选地，所述寡聚核苷酸序列中的一个以上胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T被替换为尿嘧啶脱氧核糖核苷酸U。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述寡聚核苷酸序列的3’端具有阻断所述寡聚核苷酸序列延伸的修饰；优选地，所述修饰为双脱氧胞苷
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述阻断剂与所述捕获探针的浓度比为1:1至5:1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在所述步骤1)和所述步骤2)之间、所述步骤2)和所述步骤3)之间、所述步骤3)和所述步骤4)之间和/或所述步骤4)和所述步骤5)之间，还包括洗涤步骤；优选地，所述洗涤步骤为洗涤2-4次；优选地，所述洗涤步骤所使用的洗涤缓冲液为：0.05％Tween 20，1×PBS，pH 7.0。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述分析物包含蛋白质。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述固相基质具有与所述捕获探针结合的修饰基团a；优选地，所述固相基质为磁珠；优选地，所述修饰基团a为oligo-dT或链霉亲和素。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述捕获探针为一条以上单链DNA，所述捕获探针具有与所述修饰基团a结合的修饰基团b，所述捕获探针与所述第一邻位探针的所述第一核苷酸部分互补杂交；优选地，所述修饰基团b为poly A或生物素；优选地，所述捕获探针为一条单链DNA，所述单链DNA由15-35个核苷酸组成。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述第一结合部分和所述第二结合部分各自为核酸适体、抗体或抗体的抗原结合片段，所述第一核苷酸部分和所述第二核苷酸部分各自为一条以上单链DNA，所述第一核苷酸部分的一条以上单链DNA包含与捕获探针互补杂交的核苷酸序列；优选地，所述一条以上单链DNA的长度为30-100个核苷酸；优选地，所述一条以上单链DNA中的每一条的一个末端具有选自巯基、氨基、叠氮基的修饰基团c，所述修饰基团c与偶联剂反应以将所述第一核苷酸部分的一条以上单链DNA与所述第一结合部分偶联、将所述第二核苷酸部分的一条以上单链DNA与所述第二结合部分偶联；优选地，所述偶联剂选自EMCS、sulfo-SMCC、Sulfo-LC-SPDP或SMPB中的一种以上；优选地，所述第一结合部分和所述第二结合部分分别结合同一分析物的不同表位。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述免疫复合物由所述第一邻位探针、所述第二邻位探针和所述分析物组成。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述步骤4)中，加入连接寡聚核苷酸和连接酶，使所述第一核苷酸部分的游离末端与所述第二核苷酸部分的游离末端连接形成所述核酸报告分子；优选地，所述连接酶选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述检测采用qPCR检测；优选地，在所述qPCR检测之前或在所述qPCR检测过程中加入UNG酶以降解所述阻断剂。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，在所述步骤4)和所述步骤5)之间还包括洗脱步骤使所述免疫复合物与所述固相基质脱离；优选地，所述洗脱步骤包括加入无酶无菌水，在70℃-95℃下孵育10-20分钟。
16.用于权利要求1-15中任一项所述方法的阻断剂，其中，所述阻断剂用于封闭捕获探针。
17.根据权利要求16所述的阻断剂，其中，所述阻断剂包含寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸组成；优选地，在所述阻断剂与所...
【技术特征摘要】
1.一种检测方法，所述方法依次包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阻断剂包含寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的至少15个连续核苷酸组成；优选地，在所述阻断剂与所述捕获探针结合后，所述捕获探针的3’端和/或5’端暴露的连续核苷酸的数量为7个以下，优选地，5个以下。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述阻断剂为寡聚核苷酸序列，所述寡聚核苷酸序列包含与所述捕获探针互补杂交的15-35个连续核苷酸或由与所述捕获探针互补杂交的15-35个连续核苷酸组成。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述寡聚核苷酸序列包含腺嘌呤脱氧核糖核苷酸a、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸g、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸c和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸t；优选地，所述寡聚核苷酸序列中的一个以上胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸t被替换为尿嘧啶脱氧核糖核苷酸u。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述寡聚核苷酸序列的3’端具有阻断所述寡聚核苷酸序列延伸的修饰；优选地，所述修饰为双脱氧胞苷ddc修饰。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述阻断剂与所述捕获探针的浓度比为1:1至5:1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在所述步骤1)和所述步骤2)之间、所述步骤2)和所述步骤3)之间、所述步骤3)和所述步骤4)之间和/或所述步骤4)和所述步骤5)之间，还包括洗涤步骤；优选地，所述洗涤步骤为洗涤2-4次；优选地，所述洗涤步骤所使用的洗涤缓冲液为：0.05％tween 20，1×pbs，ph 7.0。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述分析物包含蛋白质。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述固相基质具有与所述捕获探针结合的修饰基团a；优选地，所述固相基质为磁珠；优选地，所述修饰基团a为oligo-dt或链霉亲和素。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述捕获探针为一条以上单链dna，所述捕获探针具有与所述修饰基团a结合的修饰基团b，所述捕获探针与所述第一邻位探针的所述第一核苷酸部分互补杂交；优选地，所述修饰基团b为poly a或生物素；优选地，所述捕获探针为一条单链dna，所述单链dna由15-35个核苷酸组成。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述第一结合部分和所述第二结合部分各自为核酸适体、抗体或抗体的抗原结合片段，所述第一核苷酸部分和所述第二核苷酸部分各自为一条以上单链dna，所述第一核苷酸部分的一条以上单链dna包含与捕获探针互补杂交的核苷酸序列；优选地，所述一条以上单链dna的长度为30-100个核苷酸；优选地，...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐洪涛，宋晓东，许俊泉，屈彬彬，赵敏，
申请(专利权)人：格物致和生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。