基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法技术

本发明专利技术提供基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法，所述方法包括用磁珠对待测生物靶标进行处理、富集和捕获，所述待测生物靶标的液体和中介配体反应液分别在压力驱动下进入微流控芯片内，将连接所述中介配体的磁珠随机平铺并固定到所述微流控芯片反应区平面上，在所述微流控芯片反应区平面上进行所述液相-固相原位发光反应，获得反应后所述微流控芯片反应区平面上的数字图片，然后采用虚拟分割方法，实现所述待测生物靶标的数字化定量检测。本发明专利技术整个方法所要求的检测系统大大简化，检测耗材和检测系统成本大大降低，大大拓宽了数字定量技术应用。大大拓宽了数字定量技术应用。大大拓宽了数字定量技术应用。

【技术实现步骤摘要】
基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法。

技术介绍

[0002]体外诊断技术(In Vitro Diagnosis，IVD)是在人体之外，通过对人体的样品(血液、体液、组织等)进行样品处理、生化反应以及结果检测，从而获得临床诊断信息的技术。体外诊断技术的检测对象是液体，常规检测体积1～100ml。液体中的生物、化学物质主要是核酸分子(DNA/RNA)，蛋白分子。体外诊断检测的主要人体样品是血液。由于正常人体生物、化学物质在血液中的浓度相对恒定，特定生物、化学物质的浓度变化，可以表征人体是否处于健康状态。体外诊断过程可以分为以下三个阶段。
[0003](一)样品处理
[0004]人体样品，尤其是血液，含有多种生物、化学物质，例如DNA/蛋白靶分子。需要对样品进行处理，对待检测的靶分子进行富集、纯化，从而减少人体样品中其余物质对生化反应和结果检测的干扰。
[0005](二)生化反应
[0006]体外诊断中，经过处理和捕获的靶分子一般浓度较低。需要经过配体放大反应，增大靶分子物质量或者表征靶分子的物质量。例如，常用的DNA靶分子配体放大反应是PCR反应，通过反应增大待测DNA分子的物质总量；常用的蛋白靶分子配体放大反应是ELISA(酶联促发反应)，通过反应生成大量化学发光分子用于表征蛋白靶分子，增大蛋白靶分子的检测信号。
[0007](三)结果检测
[0008]常规生物、化学检测技术基于光学检测。经过配体放大反应后，较高浓度的核酸、蛋白光学标记物(例如荧光基团、化学发光物质)通过光学器件检测，例如光电倍增管(PMT)或者CCD/CMOS成像光学器件。
[0009]针对人体样品(尤其是血液)中痕量靶分子的可靠、灵敏、快速检测，是目前精准医学的重大需求。其中，数字化检测技术是目前的重点研发技术。数字化检测的核心过程是将待测样品均匀分配到大量的反应单元中，这些反应单元同时进行生化反应并进行结果检测。以针对核酸分子检测的数字PCR技术为例，策略是：将一个待测样品均匀分配到大量微小的反应单元中；然后，这些微小的反应单元同时进行PCR扩增反应，实现单拷贝或者多拷贝靶序列分子PCR扩增；扩增后，对每个反应单元检测到的荧光信号设定一个阈值，高于阈值时荧光信号的反应单元判读为1(“阳性”)，低于阈值时荧光信号的反应单元判读为0(“阴性”)。理论上讲，每个反应单元中靶序列分子(DNA模板)的分配存在三种可能性：零拷贝、一个拷贝或多个拷贝。当反应单元的数目足够大，大部分反应单元的内部只含有一个拷贝或者零拷贝靶序列分子(近似于泊松分布)，从而实现单拷贝靶序列分子PCR扩增。最后，通过统计阳性和阴性两种信号类型的反应单元比例和数目，并进行泊松统计学分析，最终计算
出原始待测样本中的靶序列拷贝数。
[0010]以针对蛋白检测的数字ELISA技术为例，策略是：通过磁珠在样品中捕获待测蛋白靶分子。捕获到蛋白的磁珠被分配到与其尺寸接近的微坑阵列中，每个微坑只能容纳一个磁珠，每个微坑被氟化油单独隔离。然后，每个微坑进行ELISA反应。反应后，对每个反应单元检测到的发光信号设定一个阈值，高于阈值时发光信号的反应单元判读为1(“阳性”)，低于阈值时发光信号的反应单元判读为0(“阴性”)。理论上讲，每个磁珠捕获蛋白靶分子存在三种可能性：零分子、单分子或者多分子。当磁珠的数目足够大，大部分磁珠只捕获一个蛋白靶分子或者零蛋白靶分子；最终，大部分反应单元的内部只含有一个分子或者零分子，从而实现单分子光学信号放大。最后，通过统计阳性和阴性两种信号类型的反应单元比例和数目，并进行泊松统计学分析，最终计算出原始待测样本中的蛋白靶分子数目。
[0011]数字化检测的核心概念是：
[0012](1)反应单元之间相互独立。每个反应单元内的生化反应不与其他反应单元的生化反应“串扰”。以针对核酸检测的数字PCR技术为例，两个反应单元内的PCR反应不能相互“串扰”；以针对蛋白检测的数字ELISA技术为例，两个反应单元内的ELISA反应不能相互“串扰”。
[0013](2)反应单元空间尺寸均一，分布随机性。待测样品分布到每个反应单元的概率一样，为结果检测的精准分析奠定基础。
[0014](3)反应单元数目远远高于待检测的DNA/蛋白靶分子。从而，低浓度靶分子进入反应单元符合泊松分布，为结果检测的数据分析奠定理论基础。
[0015]反应单元不相互独立、反应单元空间尺寸不均一以及反应单元数目过低，都会对下游的结果检测产生误差。
[0016]数字化检测技术的优点是：
[0017](1)绝对定量。可以直接计算靶分子的绝对数目，无需依赖于对照标准样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。
[0018](2)灵敏度高。可在物理层面实现单分子级检测。对每个反应单元的反应结果判读仅判断有/无两种状态。高于阈值时荧光信号的反应单元判读为1(“阳性”)，低于阈值时荧光信号的反应单元判读为0(“阴性”)。
[0019](3)准确度高。待测样品的反应体系分配过程可以极大降低与靶分子有竞争性作用的背景物质浓度，对生化反应抑制物的耐受能力也大大提高，因此数字化检测技术非常适合在复杂背景中检测痕量DNA/蛋白靶分子。
[0020]现有数字化检测技术的不足是：
[0021](1)数字化检测技术相关的微流体芯片设计、加工要求高。现有数字化检测技术需要设计、加工微米量级高精密微流体芯片，对待测DNA/蛋白靶分子进行均匀物理分割。例如“油包水”数字PCR技术(伯乐、Raindance)，需要设计、加工几十～上百微米尺度的高精度微流道，并且利用油和水不相溶的特性，从而形成尺寸均一的独立反应单元(“微液滴”)。微坑式数字PCR芯片(赛默飞芯片)，需要在硅基上加工尺度是几十微米的均匀微坑阵列，微坑上层覆盖氟化油，对样品物理隔离，形成尺寸均一的独立反应单元(“微坑”)。微坑式数字ELISA芯片(Quanterix公司)，需要在聚合物表面加工几微米量级的高密度微坑阵列，单个磁珠被分配到微坑中，上层覆盖氟化油，实现样品物理隔离，形成尺寸均一的独立反应单元
(“微坑”)。
[0022](2)数字化检测技术对于检测器的要求高。物理分割后的单元经过生化反应(PCR、ELISA)，需要通过流式检测或者高清成像技术进行检测和分析。
[0023]目前体外诊断，急需可靠、灵敏、快速，并且价格低廉的数字化检测方法，实现数字化精准诊断，对疾病做到早诊、早治、早预防。

技术实现思路

[0024]为了解决上述问题，本专利技术提供一种基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：用磁珠对待测生物靶标进行处理、富集和捕获，所述磁珠表面修饰有与待测生物靶标特异连接的配体分子，浓缩富集得到含有所述待测生物靶标的液体；步骤2：将所述待测生物靶标的液体和中介配体反应液分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：用磁珠对待测生物靶标进行处理、富集和捕获，所述磁珠表面修饰有与待测生物靶标特异连接的配体分子，浓缩富集得到含有所述待测生物靶标的液体；步骤2：将所述待测生物靶标的液体和中介配体反应液分别在压力驱动下进入微流控芯片内，在所述微流控芯片内，连接在所述磁珠上的待测生物靶标与中介配体结合，所述中介配体的作用是催化液相-固相原位发光反应；步骤3：将连接所述中介配体的磁珠随机平铺并固定到所述微流控芯片反应区平面上；步骤4：在所述微流控芯片反应区平面上进行所述液相-固相原位发光反应，该反应对待测生物靶标进行光学放大，在含有待测生物靶标的磁珠周边形成固相发光区域；并且所述微流控芯片反应区平面上事先修饰与所述液相-固相原位发光反应生成的发光分子结合的功能基团，使得反应生成的发光分子共价连接到所述反应区平面上；和步骤5：获得反应后所述微流控芯片反应区平面上的数字图片，然后采用虚拟分割方法，实现所述待测生物靶标的数字化定量检测。2.根据权利要求1所述的生物靶标数字化定量芯片检测方法，其特征在于，所述生物靶标是DNA和/或蛋白质分子。3.根据权利要求1所述的生物靶标数字化定量芯片检测方法，其特征在于，所述步骤1包括：在所述磁珠表面修饰与待测生物靶标特异连接的配体分子；修饰后的磁珠捕获待测生物靶标；利用磁力对所述捕获待测生物靶标进行清洗和纯化；然后将纯化后的待测生物靶标在液体中均匀分布。4.根据权利要求1所述的生物靶标数字化定量芯片检测方法，其特征在于，在所述步骤2中，在所述微流控芯片反应区内施加磁铁，使得捕获待测生物靶标的磁珠吸附到所述芯片反应区底部。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：荆高山，王栋，许俊泉，
申请(专利权)人：格物致和生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：