一种食源性致病菌的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种食源性致病菌的检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括以下组分：（1）沙门氏菌的引物对；沙门氏菌特异性探针；（2）金黄色葡萄球菌的引物对；金黄色葡萄球菌特异性探针；（3）大肠杆菌O157:H7的引物对；大肠杆菌O157:H7特异性探针；（4）副溶血弧菌的引物对；副溶血弧菌特异性探针；（5）单核细胞增生李斯特菌的引物对；单核细胞增生李斯特菌特异性探针。本发明专利技术提供的试剂盒和检测方法可同时检出食品中的5种致病菌，具有特异性强,灵敏度高,检测快速等特点,能满足日常快速检测食品的要求,同时可以免除昂贵仪器的投入，可以推广至食品生产企业及相关检测机构使用。

【技术实现步骤摘要】
一种食源性致病菌的检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物学和食品安全检测领域，具体为一种食源性致病菌的检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
伴随着社会经济的发展，人们的生活中越来越少不了各种美味。大街小巷，天南地北的各种小吃和食物每时每刻的都在吸引着大家的眼球。美味是不可不吃的，但是要吃也要吃那些干净卫生的食物，这样才能避免食源性疾病的发生，保证健康。食源性致病菌作为引发食源性疾病的重要因素，已经引起各界的广泛重视。通常引发食源性疾病的致病菌主要有:(1)致病性大肠埃希菌：大肠埃希氏菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，长有鞭毛，能运动。致病性大肠埃希氏菌可分为:肠产毒素性大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠凝聚性大肠埃希氏菌、扩散粘附性大肠埃希氏菌。引发出血性腹泻的通常为大肠埃希菌0157:H7较为常见。由肠出血性大肠埃希氏菌(0157:H7)引起的肠道疾病可表现出轻度腹挥、水样便、继以大量出血等症状。(2)沙门氏菌：沙门氏菌(Salmonella)为沙门氏菌属肠杆菌科，无芽孢、无荚膜的革兰氏阴性直杆菌，多数具有菌毛，沙门氏菌血清型众多，全球已发现2523个血清型，我国约存在300个，这些血清型均可引起食源性疾病，由沙门氏菌引起的临床症状通常在感染后12~72h内出现，主要表现为发烧、头痛、恶心、呕吐、腹痛和腹泻等。(3)单核细胞增生李斯特氏菌：单核细胞增生李斯特氏菌简称单增李斯特菌，为李斯特氏菌属(Listeria)，革兰氏阳性短杆菌，芽孢和荚膜，需氧或兼性厌氧。单核细胞增生李斯特菌被分为16个血清型，其中l/2a、l/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a、4b均被认为是具有致病特性的致病菌株。(4)副溶血性弧菌：副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus)系弧菌科弧菌属，革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，嗜盐，在无盐培养基上不能生长。副溶血性弧菌产生的毒素主要有两种，即:耐热性溶血素TD(thermostabledirecthemolysin)和TDH(TDHrelatedhemolysinTRxO)两类。主要表现为腹痛，多为阵发性绞痛，并伴有腹泻、恶心、呕吐、发热等症状的急性胃肠炎，感染者的粪便多呈水样，且混有黏液或脓血。(5)金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)属于微球菌科葡萄球菌属，该菌无芽孢、鞭毛，多数无荚膜，为需氧或兼性厌氧菌。人感染金黄色葡萄球菌后主要引起恶心、呕吐、腹部痉挛、水性或血性腹泻等胃肠道症状，严重者可引起局部化脓感染，如肺炎、盆腔炎、心包炎，甚至败血症、脓毒症等全身性感染。在一般生鲜食品如果蔬类、肉禽类、海产类及其加工产品中普遍存在，危及人类健康，甚至引发大规模的传染性疾病。传统检测致病菌采用细菌培养、分离、鉴定等一系列步骤，不仅操作时间长，而且检出敏感性差，不利于对食品质量把关。所以专利技术一种耗时短，易推广的检测方法对食源性致病进行检测、监控，对保障食品生产、加工及物流过程中的质量安全具有积极的作用。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种可同时检测五种致病菌的检测试剂盒及检测方法，具有检测时间短、灵敏度高的特点。本专利技术通过以下技术方案实现：一种食源性致病菌的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：（1）沙门氏菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；沙门氏菌特异性探针；（2）金黄色葡萄球菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.4所示，下游引物如SEQIDNO.5所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；金黄色葡萄球菌特异性探针；（3）大肠杆菌O157:H7的引物对：上游引物如SEQIDNO.7所示，下游引物如SEQIDNO.8所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；大肠杆菌O157:H7特异性探针；（4）副溶血弧菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.10所示，下游引物如SEQIDNO.11所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；副溶血弧菌特异性探针；（5）单核细胞增生李斯特菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.13所示，下游引物如SEQIDNO.14所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；单核细胞增生李斯特菌特异性探针。进一步的，该试剂盒包括以下组分：（1）沙门氏菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，浓度为0.4μmol/L；沙门氏菌特异性探针；（2）金黄色葡萄球菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.4所示，下游引物如SEQIDNO.5所示，浓度为0.4μmol/L；金黄色葡萄球菌特异性探针；（3）大肠杆菌O157:H7的引物对：上游引物如SEQIDNO.7所示，下游引物如SEQIDNO.8所示，浓度为0.4μmol/L；大肠杆菌O157:H7特异性探针；（4）副溶血弧菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.10所示，下游引物如SEQIDNO.11所示，浓度为0.4μmol/L；副溶血弧菌特异性探针；（5）单核细胞增生李斯特菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.13所示，下游引物如SEQIDNO.14所示，浓度为0.4μmol/L；单核细胞增生李斯特菌特异性探针。进一步的，所述沙门氏菌特异性探针、金黄色葡萄球菌特异性探针、大肠杆菌O157:H7特异性探针、副溶血弧菌特异性探针、单核细胞增生李斯特菌特异性探针均为Taqman探针。进一步的，所述沙门氏菌特异性探针如SEQIDNO.3所示，金黄色葡萄球菌特异性探针如SEQIDNO.6所示，大肠杆菌O157:H7特异性探针如SEQIDNO.9所示，副溶血弧菌特异性探针如SEQIDNO.12所示，单核细胞增生李斯特菌特异性探针如SEQIDNO.15所示。进一步的，所述沙门氏菌特异性探针中，在探针中间距5’端29bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’末端通过基团phosphate修饰；所述金黄色葡萄球菌特异性探针中，在探针中间距5’端31bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’末端通过基团phosphate修饰；所述大肠杆菌O157:H7特异性探针中，在探针中间距5’端28bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’末端通过基团phosphate修饰；所述副溶血弧菌特异性探针中，在探针中间距5’端28bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’末端通过基团phosphate修饰；所述单核细胞增生李斯特菌特异性探针中，在探针中间距5’端30bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食源性致病菌的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：/n（1）沙门氏菌的引物对：上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；沙门氏菌特异性探针；/n（2）金黄色葡萄球菌的引物对：上游引物如SEQ ID NO.4所示，下游引物如SEQ ID NO.5所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；金黄色葡萄球菌特异性探针；/n（3）大肠杆菌O157:H7的引物对：上游引物如SEQ ID NO.7所示，下游引物如SEQ IDNO.8所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；大肠杆菌O157:H7特异性探针；/n（4）副溶血弧菌的引物对：上游引物如SEQ ID NO.10所示，下游引物如SEQ ID NO.11所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；副溶血弧菌特异性探针；/n（5）单核细胞增生李斯特菌的引物对：上游引物如SEQ ID NO.13所示，下游引物如SEQID NO.14所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；单核细胞增生李斯特菌特异性探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种食源性致病菌的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：
（1）沙门氏菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；沙门氏菌特异性探针；
（2）金黄色葡萄球菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.4所示，下游引物如SEQIDNO.5所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；金黄色葡萄球菌特异性探针；
（3）大肠杆菌O157:H7的引物对：上游引物如SEQIDNO.7所示，下游引物如SEQIDNO.8所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；大肠杆菌O157:H7特异性探针；
（4）副溶血弧菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.10所示，下游引物如SEQIDNO.11所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；副溶血弧菌特异性探针；
（5）单核细胞增生李斯特菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.13所示，下游引物如SEQIDNO.14所示，浓度为0.3-0.5μmol/L；单核细胞增生李斯特菌特异性探针。


2.根据权利要求1所述的食源性致病菌的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：
（1）沙门氏菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，浓度为0.4μmol/L；沙门氏菌特异性探针；
（2）金黄色葡萄球菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.4所示，下游引物如SEQIDNO.5所示，浓度为0.4μmol/L；金黄色葡萄球菌特异性探针；
（3）大肠杆菌O157:H7的引物对：上游引物如SEQIDNO.7所示，下游引物如SEQIDNO.8所示，浓度为0.4μmol/L；大肠杆菌O157:H7特异性探针；
（4）副溶血弧菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.10所示，下游引物如SEQIDNO.11所示，浓度为0.4μmol/L；副溶血弧菌特异性探针；
（5）单核细胞增生李斯特菌的引物对：上游引物如SEQIDNO.13所示，下游引物如SEQIDNO.14所示，浓度为0.4μmol/L；单核细胞增生李斯特菌特异性探针。


3.根据权利要求2所述的食源性致病菌的检测试剂盒，其特征在于，
所述沙门氏菌特异性探针、金黄色葡萄球菌特异性探针、大肠杆菌O157:H7特异性探针、副溶血弧菌特异性探针、单核细胞增生李斯特菌特异性探针均为Taqman探针。


4.根据权利要求3所述的食源性致病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述沙门氏菌特异性探针如SEQIDNO.3所示，金黄色葡萄球菌特异性探针如SEQIDNO.6所示，大肠杆菌O157:H7特异性探针如SEQIDNO.9所示，副溶血弧菌特异性探针如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，佘之蕴，綦艳，严家俊，杨纯佳，周臣清，
申请(专利权)人：广东产品质量监督检验研究院国家质量技术监督局广州电气安全检验所，广东省试验认证研究院，华安实验室，
类型：发明
国别省市：广东;44