用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的LAMP引物及环介导等温扩增检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种扩增检测试剂盒，特别涉及一种用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的LAMP引物及环介导等温扩增检测试剂盒。本发明专利技术研究并开发了宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病环介导等温扩增检测方法；该方法基于环介导等温扩增原理，针对鹦鹉热衣原体ompA基因设计通用扩增引物，通过调整反应试剂配比及引物组构建反应体系，优化反应时间，只需使用恒温加热仪器或者水浴锅，无需专业人员，30分钟可以根据反应显色差异判断结果，可以检测包括基因型A、B、C、D、E、F、E/B、M56、WC 9种鹦鹉热衣原体。大大缩短了实验的时间并降低了实验开展的条件，让基层单位开展宠物疫病的快速诊断变成现实，达到人兽共患衣原体快速诊断的目的。

【技术实现步骤摘要】
用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的LAMP引物及环介导等温扩增检测试剂盒
本专利技术涉及一种扩增检测试剂盒，特别涉及一种用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的LAMP引物及环介导等温扩增检测试剂盒。
技术介绍
未来5～10年中国宠物市场将以至少20％的速度增长，目前，我国拥有超过1.5亿只宠物狗，养异宠及观赏鸟等宠物的人群也正在逐渐增加。而中国的宠物诊疗行业鱼龙混杂，宠物健康管理困难等问题突出。随着生物技术的不断发展，研究出了一系列宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病检测的分子生物学方法。其中主要有PCR技术、荧光定量PCR技术、环介导等温扩增技术(LAMP)，但在实际应用中并非所有的技术都起到很好的应用效果，其中PCR技术成本低，检测技术成熟，准确性高，但操作费时费力，一般需要凝胶电泳进行结果判定，检测周期较长，满足不了疫病现场快速检测的目的；荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光标记探针，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和对未知模板进行定量分析的方法区分，该检测技术无需凝胶电泳进行结果判读，但需要大型荧光定量PCR仪器，同时对样本质量要求较高，且操作程序较为复杂，对操作人员要求比较高，这限制了该技术在基层的推广使用。首先，人畜共患病监测体系薄弱，有数据表明，鸽、鹦鹉等观赏鸟中发现病例数远低于人鹦鹉热感染病例数，不能发挥关口前移的预警作用，二是人兽共患衣原体病例大多数为临床诊断病例或疑似病例，缺乏实验室诊断确诊技术，相关意识需要加强。三是信息收集、利用尚不充分，部分宠物医疗机构没有对疫情采取有效地反馈和上报。四是系统收集的信息局限，不能满足防治的需求，缺乏人兽共患衣原体病的准确数据。因此，作为人兽共患病的检测和监测，需整合宠物医疗机构，兽医主管等部门各自优势，宠物医疗机构在发现宠物人兽共患病后，既可及时通知宠物主，有效控制疫病对人的威胁；又可实现病原检测信息收集，为主管部门及时、定位、处置突发疫病提供数据基础。随着信息、生物技术发展，我国的动物疫病诊断试剂推陈出新。然而，目前市场上缺乏宠物人兽共患病疫病诊断试剂及配套检测体系统。且部分企业没有标准化的诊断试剂GMP生产线，产品质量不稳定，检测结果无法保障，更没有配套检测系统用于数据收集、信息集成，不利于宠物人兽共患病的监测工作。分子生物学方法特别是PCR、荧光定量PCR技术能特异性地检测到鹦鹉热衣原体,以提高鹦鹉热衣原体病临床诊断的准确性,然而这些方法普遍存在着操作复杂、费时的问题，且依赖大型仪器(PCR仪、凝胶成像系统)和专业人员，不便于快速检验以指导临床,使该方法在基层推广造成了极大障碍。环介导等温扩增技术是日本学者Notomi建立的一种新的核酸等温扩增技术，自LAMP技术建立以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫等病原菌的检测研究。LAMP检测技术根据基层病例零散、设备简陋，操作人员水品有限等特点，在检测方法设计上突出简单、便捷，快速等特性，实现了对未知样品现场快速筛查技术创新；LAMP检测技术灵敏度高、特异性强、专利设计抗气溶胶污染能力强，30分钟即可完成检测，完美实现了快速诊断的目的，更加符合宠物临床诊断的时限要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的LAMP引物。本专利技术的另一目的在于提供一种用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的环介导等温扩增检测试剂盒。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测鹦鹉热衣原体的LAMP引物，该LAMP引物包括：引物F3：5’-CTAAGCATAATCTTTAGAGGTGAGTATGA-3’，即SEQIDNO.2，引物B3：5’-CATAATCTCCGTAGTATCCTGCG-3’，即SEQIDNO.3，引物FIP：5’-GGTTCCCTACAGGCAAGGCTAAACTCTTGAAATCGGCATTATTGTT-3’，即SEQIDNO.4，引物BIP：5’-TGTGGGAAGGTGCTTCAGGAGGGATGCTAATGGCGTCACA-3’，即SEQIDNO.5，引物LoopF：5’-AGGAGAGAGCGGAACCC-3’，即SEQIDNO.6，引物LoopB：5’-ATCCTTGCGATCCTTGCG-3’，即SEQIDNO.7。一种含有所述的LAMP引物的宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病环介导等温扩增检测试剂盒。作为优选，所述试剂盒还包括dNTPs、BstDNA聚合酶、Buffer、Mg2+中的至少一种。作为优选，所述试剂盒还包括模板DNA。一种所述的LAMP引物或所述的试剂盒在宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病环介导等温扩增检测方面的应用。LAMP检测技术灵敏度高、特异性强、抗气溶胶污染能力强，30分钟即可完成检测，完美实现了快速诊断的目的，更加符合宠物临床诊断的时限要求。所述的应用包括以下步骤：1)提取样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述LAMP引物进行扩增反应；3)分析扩增产物。作为优选，步骤1)中样本裂解液组成是：25mMtris-HCL、5mMEDTA、0.1％SDS、1％tween-20。作为优选，扩增反应条件：反应时间为30-40分钟，反应温度为64-65℃。作为优选，步骤3)具体为：向步骤2)的扩增产物中加入SYBRGreenI染料，根据显色情况判定结果：显示荧光绿为阳性，橙色为阴性。本专利技术研究并开发了宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病环介导等温扩增检测方法；该方法基于环介导等温扩增原理，针对鹦鹉热衣原体ompA基因设计通用扩增引物，通过调整反应试剂配比及引物组构建反应体系，优化反应时间，只需使用恒温加热仪器或者水浴锅，无需专业人员，30分钟可以根据反应显色差异判断结果，可以检测包括基因型A、B、C、D、E、F、E/B、M56、WC9种鹦鹉热衣原体。大大缩短了实验的时间并降低了实验开展的条件，让基层单位开展宠物疫病的快速诊断变成现实，达到人兽共患衣原体快速诊断的目的。本专利技术中，①通过比对数据库中鹦鹉热衣原体9种基因型A、B、C、D、E、F、E/B、M56、WC保守序列设计通用引物1套，通过调整反应试剂配以及引物组构建反应体系，优化反应时间，成功建立宠物鸽、鸟、宠物(犬猫)人兽共患衣原体病(鹦鹉热衣原体)环介导等温扩增检测方法，初步用该方法检验鹦鹉热衣原体阳性标准样本检测结果表明该方法敏感性、特异性良好。②通过宠物鸽鸟人兽共患衣原体病(鹦鹉热衣原体)环介导等温扩增检测技术与传统PCR方法对比实验，对真实样本测试结果表明环介导等温扩增检测技术的准确性与普通PCR方法一致且灵敏性更高。③通过宠物鸽鸟人兽共患衣原体病(鹦鹉热衣原体)环介导等温扩增检测技术与荧光PCR方法对比实验，对阳性梯度稀释样本测试结果表明环介导等温扩增检测技术的灵敏性、特异性与传统荧光定量PCR相当。本专利技术的有益效果是：1)LAMP方法基于恒温扩增的原理，只需使用恒温本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测鹦鹉热衣原体的LAMP引物，其特征在于，该LAMP引物包括：/n引物F3：5’-CTAAGCATAATCTTTAGAGGTGAGTATGA-3’，即SEQ ID NO.2，/n引物B3：5’-CATAATCTCCGTAGTATCCTGCG-3’，即SEQ ID NO.3，/n引物FIP：5’-GGTTCCCTACAGGCAAGGCTAAACTCTTGAAATCGGCATTATTGTT-3’，即SEQ IDNO.4，/n引物BIP：5’-TGTGGGAAGGTGCTTCAGGAGGGATGCTAATGGCGTCACA-3’，即SEQ ID NO.5，/n引物LoopF：5’-AGGAGAGAGCGGAACCC-3’，即SEQ ID NO.6，/n引物LoopB：5’-ATCCTTGCGATCCTTGCG-3’，即SEQ ID NO.7。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鹦鹉热衣原体的LAMP引物，其特征在于，该LAMP引物包括：
引物F3：5’-CTAAGCATAATCTTTAGAGGTGAGTATGA-3’，即SEQIDNO.2，
引物B3：5’-CATAATCTCCGTAGTATCCTGCG-3’，即SEQIDNO.3，
引物FIP：5’-GGTTCCCTACAGGCAAGGCTAAACTCTTGAAATCGGCATTATTGTT-3’，即SEQIDNO.4，
引物BIP：5’-TGTGGGAAGGTGCTTCAGGAGGGATGCTAATGGCGTCACA-3’，即SEQIDNO.5，
引物LoopF：5’-AGGAGAGAGCGGAACCC-3’，即SEQIDNO.6，
引物LoopB：5’-ATCCTTGCGATCCTTGCG-3’，即SEQIDNO.7。


2.一种含有权利要求1所述的LAMP引物的宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病环介导等温扩增检测试剂盒。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括dNTPs、Bst...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海云，杨秀环，李壹，唐艳荣，张小梅，王雅琴，曹院章，何宏轩，
申请(专利权)人：北京市朝阳区动植物疫病预防控制中心北京市朝阳区农产品质量安全综合检测站，
类型：发明
国别省市：北京;11