医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'‑CCACTCAGCTTGATGTAA‑3'；反向序列：5'‑GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC‑3'；探针序列：5'‑6‑FAM‑ACAACAGCACCACGACGAT‑TAMRA‑3'；一种医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：称取25 g样品至盛有225 mL无菌水的均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释，得到待测样品；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液后进行检测与分析。结果表明该引物对海氏肠球菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为10

【技术实现步骤摘要】
医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法。
技术介绍
微滴数字PCR的工作原理在于将被标记的样品分割形成若干独立的反应体系，每个独立反应体系中不含或含有一个及以上待测靶标序列，含有待测靶标的为阳性，不含待测靶标的为阴性。在每个独立反应体系中对被标记的样品进行PCR反应，反应到达终点后，含有待测基因靶标的反应体系中可检测到荧光信号，不含待测基因靶标时没有信号积累，读取阴性、阳性微滴的数量后传至数据处理软件得到最终结果。微滴数字PCR精准性高、检出限低、重复性及稳定性好。其灵敏度优于传统方法及qPCR等方法，可达到qPCR方法的10倍甚至更高；在一定检测范围内，线性关系良好，标准偏差小，准确度高，且不同实验室或检测机构间重复实验结果波动小。在检测过程中只需读取最终结果，不需要依赖标准曲线，可以避免制作标准曲线过程中引起的检测误差，也可减少实验成本。数字PCR检测所需时间短，从提取DNA到完成检测仅需1d，弥补了传统培养法耗时久的缺陷。海氏肠球菌（Enterococcushirae）可产乳酸链球菌素Nisin，能够作为潜在益生菌用于养殖中抗致病性弧菌，但由于部分海氏肠球菌能够引起心内膜炎、细菌性肺炎等感染性疾病，并且具有多重抗药性，对人体健康能够造成一定危险，因此对食品中海氏肠球菌的检测有着重要的意义。本专利技术基于海氏肠球菌gyrb基因序列设计引物探针，建立了数字PCR检测方法，为海氏肠球菌在医用食品中的定量检测提供参考。r>
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有方法对海氏肠球菌检测过程中定量检测限较高、耗时较久等问题，建立一种快速、灵敏度高的医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法。医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：1）海氏肠球菌标准菌株使用MRS液体培养基，37°C静置培养18h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37°C培养24h；称取25g样品至有225mL无菌水的无菌均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释；2）分别取1mL阳性对照、阴性对照、待测样品提取DNA；3）获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；4）将步骤2中所得DNA进行微滴式数字PCR扩增，反应体系为：2×ddPCRSupermixforProbes（NodUTP）10µL、引物（10µM）各0.4µL、探针（10µM）0.4µL、DNA模版1µL，ddH2O补足至20µL。充分混匀后轻微离心，20µL混合液全量转移至Bio-RadDG8TM微滴生成卡中，去除其中气泡，添加70µL微滴生成油，固定微滴生成卡衬垫后，放置于QX100TMDropletGenerator仪器中生成油包水液滴。生成后微滴全量转移至96孔板中，封膜后使用普通PCR仪进行扩增反应。PCR反应程序为：95°C10min，1个循环；95°C30s，56°C30s，40个循环；98°C10min，1个循环；12°C降温保存产物。5）反应结束后使用QX100TMDropletReader对步骤4）中反应液读取微滴数及荧光信号，并进行数据处理。步骤3）中所述的鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'-CCACTCAGCTTGATGTAA-3'；反向序列：5'-GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC-3'；探针：5'-6-FAM-ACAACAGCACCACGACGAT-TAMRA-3'。步骤1）中所述的非目标菌株为：粪肠球菌（CCTCCAB2012096）、屎肠球菌（CCTCCAB2018155）、鸟肠球菌（ATCC14025）、铅黄肠球菌（ATCC700327）、鹑鸡肠球菌（ATCC49573）、戊糖片球菌（实验室分离）、植物乳杆菌（ATU8014）、鼠李糖乳杆菌（ATU7469）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、大肠希埃氏菌（ATCC25922）、肠沙门氏菌（CICC10982）、蜡样芽孢杆菌（ATCC11778-VA-1）、枯草芽孢杆菌（CCTCCWB2008974）；37°C培养24h。步骤2）中所述的提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒（索莱宝），具体包括以下步骤：取样品或菌液1mL，12,000rpm离心1min，去除上清；加入200µL溶液A，使菌体充分悬浮后加入20µLRNaseA（10mg/mL），充分颠倒混匀，室温放置15-30min。向管中加入20µL蛋白酶K（10mg/mL），充分混匀，55°C消化30-60min，颠倒混匀数次。加入200µL溶液B，充分颠倒混匀；加入200µL无水乙醇，充分混匀，将溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱中，静置2min。12,000rpm离心2min，弃废液；加入600µL漂洗液，12,000rpm离心1min，弃废液，重复两次。12,000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温放置数分钟。将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加100µL经65°C水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12,000rpm离心1min；离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到待测样品DNA。附图说明：图1海氏肠球菌特异性实验实时荧光定量PCR荧光信号图。图2海氏肠球菌质粒标准品微滴数字PCR检测灵敏度梯度散点图。图3海氏肠球菌菌液纯培养物微滴数字PCR检测灵敏度梯度散点图。图4海氏肠球菌模拟污染样品微滴数字PCR检测灵敏度梯度散点图。具体实施方式实施例1医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法1、增菌培养海氏肠球菌样品标准菌株使用MRS液体培养基，37°C静置培养18h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37°C培养24h；获得目标菌株纯培养物及对照组非目标菌株的增菌液。所述的非目标菌株如下：粪肠球菌（CCTCCAB2012096）、屎肠球菌（CCTCCAB2018155）、鸟肠球菌（ATCC14025）、铅黄肠球菌（ATCC700327）、鹑鸡肠球菌（ATCC49573）、戊糖片球菌（实验室分离）、植物乳杆菌（ATU8014）、鼠李糖乳杆菌（ATU7469）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、大肠希埃氏菌（ATCC25922）、肠沙门氏菌（CICC10982）、蜡样芽孢杆菌（ATCC11778-VA-1）、枯草芽孢杆菌（CCTCCWB2008974）。2、模拟污染样品制备海氏肠球菌培养18h后，取1mL增菌液与24g医用食品样品混合，添加至含有225mL无菌水的均质袋中，充分混匀得到模拟污染样品。3、质粒标准品制备使用普通PCR对海氏肠球菌进行扩增，上游引物5'-CCACTCAGCTTGATGTAA-3'，下游引物5'-GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC-3'。反应体系：2×TaqPCRMasterMixI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：/n1）海氏肠球菌样品标准菌株使用MRS液体培养基，37 °C静置培养24 h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37 °C培养24 h；称取25g样品至有225 mL无菌水的无菌均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释；/n2）分别取1 mL阳性对照、阴性对照、待测样品提取DNA；/n3）获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；/n4）将步骤2中所得DNA进行微滴式数字PCR扩增，反应体系为：2× ddPCR Supermix forProbes（No dUTP）10 µL、引物（10 µM）各0.4 µL、探针（10 µM）0.4 µL、DNA模版1 µL，ddH

【技术特征摘要】
1.医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：
1）海氏肠球菌样品标准菌株使用MRS液体培养基，37°C静置培养24h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37°C培养24h；称取25g样品至有225mL无菌水的无菌均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释；
2）分别取1mL阳性对照、阴性对照、待测样品提取DNA；
3）获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；
4）将步骤2中所得DNA进行微滴式数字PCR扩增，反应体系为：2×ddPCRSupermixforProbes（NodUTP）10µL、引物（10µM）各0.4µL、探针（10µM）0.4µL、DNA模版1µL，ddH2O补足至20µL；充分混匀后轻微离心，20µL混合液全量转移至Bio-RadDG8TM微滴生成卡中，去除其中气泡，添加70µL微滴生成油，固定微滴生成卡衬垫后，放置于QX100TMDropletGenerator仪器中生成油包水液滴；生成后微滴全量转移至96孔板中，封膜后使用普通PCR仪进行扩增反应；PCR反应程序为：95°C10min，1个循环；95°C30s，56°C30s，40个循环；98°C10min，1个循环；12°C降温保存产物；
5）反应结束后使用QX100TMDropletReader对步骤4）中反应液读取微滴数及荧光信号，并进行数据处理。


2.根据权利要求1所述的医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'-CCACTCAGCTTGATGTAA-3'；反向序列：5'-GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC-3'；探针：5'-6-FAM-ACAACAGCACCACGACGAT-TAMRA-3'。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云国，刘可，张捷，汤晓娟，雷智文，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37