一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法。本发明专利技术收集尽量多的公共数据库和前期研究中蜡样芽胞杆菌族群菌株基因组，对已有的菌株分类信息进行真实性确证分析，比较基因组和泛基因组方法挖掘公共数据库中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)可区分靶标，利用本组实验菌株验证和筛选区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的特征性分子靶标，包括选取分子靶标ispD基因序列中不同的SNP位点设计引物，引物对的筛选，分别以蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌为模板进行HRM实验，获得对应菌株的特征性熔解曲线信息，实现对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的准确鉴别。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法
：本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及一种通过高分辨率熔解曲线快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法。
技术介绍
：蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)和苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)同属蜡样芽胞杆菌类群。其中，蜡样芽胞杆菌是我国常见的食源性条件致病菌，可产生腹泻(肠毒素)毒素和呕吐毒素。在2008至2015年期间，蜡样芽胞杆菌在我国食源性致病菌流行率中排名第三，危害性强。苏云金芽胞杆菌是一类昆虫致病菌。其在形成芽胞的同时会形成一个或多个伴胞晶体，其主要成分是杀虫晶体蛋白，因此被广泛地用作生物杀虫剂。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌生理生化特征高度相似，可用于辨别的唯一区别是伴胞晶体的产生能力。此外，二者具有高度的遗传相似性，16SrRNA序列具有99％-100％相似性，dDDH(digitalDNA-DNAhybridization)值大于物种划分阈值70％，ANI值大于物种划分阈值95％，都高于种群鉴定的标准值，极难区分。由于世界范围内没有对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌进行有效区分的分子快速检测鉴定方法，鉴定时可能造成误判，给食品安全和产业带来极大的安全隐患。因此，亟需建立一种对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的准确区分的方法。目前，能够将蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌区分的方法仍然是传统生化方法，也是我国和美国FDA食品微生物安全检测的国家标准方法。依照此方法，需要培养苏云金芽胞杆菌4-5天来产生蛋白结晶体(伴胞晶体)，而其他芽胞杆菌不产生蛋白结晶体。该过程耗时，且如果游离芽胞形成不丰富，还需将培养物室温继续放置2-3天进行二次检查。此外，该方法受观察人员主观判断影响大，可能产生误判，在实际检测过程中不具有时效性与易操作性。近些年来，随着高通量测序技术的不断发展，基于基因组信息的分型与比对可实现蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的区分鉴定，但该方法需要进行DNA提取、二代测序、下游信息学分析等，耗时长、成本与操作要求高，不能满足实验室常规使用、高通量快速检测鉴定与基层检测的需要。已有韩国研究学者发现新型靶标XRE，可用于鉴别和区分苏云金芽胞杆菌与近缘芽胞杆菌。与已有的伴胞晶体蛋白基因靶标cry2相比，XRE基因在苏云金芽胞杆菌的鉴定中具有较高的准确性。XRE的PCR结果显示蜡样芽胞杆菌或非蜡样芽胞杆菌均未扩增，利用XRE建立的实时PCR方法可鉴定苏云金芽胞杆菌，并可利用所建立的标准曲线对细胞数量进行定量。但该靶标未能同时将苏云金芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌进行检测，未能提供一种更直观并具可视化的方法。因此，亟待建立对二者进行快速准确鉴定的新型分子方法。高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，HRM)是近年来在国外兴起的分析方法，以PCR技术为基础，通过检测目标片段单碱基差异从而进行基因变异检测与分型的分析技术。该方法不受碱基突变位点与类型局限，无需特异性探针，在PCR完成后直接运行高分辨率熔解，就可完成对样品单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)、甲基化、配型等的分析。相比较于其他分子分型诊断方法，HRM具有操作简便快速、成本低、灵敏度高、特异性好，实现了真正的闭管操作。HRM方法受到普遍关注，并已应用到各个领域，包括食品安全、环境监测、临床诊断和生物防御等领域，对细菌的鉴定及药敏试验、药物的鉴定、疾病诊断等发挥了重要作用。
技术实现思路
：本专利技术的第一个目的是提供一种新分子靶标ispD，编码了2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatecytidylyltransferase)，作为靶标基因在区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中进行应用，此应用是非疾病的和治疗目的，可在环境、食品及其生产链、临床等领域进行上述两种菌株的有效区分。所述的分子靶标ispD，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示(对应蜡样芽胞杆菌)或核苷酸序列如SEQIDNO：2所示(对应苏云金芽胞杆菌)。本专利技术的第二个目的提供一种区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的引物对，其是根据如SEQIDNO.1所示核苷酸序列(对应蜡样芽胞杆菌)设计得到，基于HRM方法利用SNP位点对两者进行有效区分，其中在蜡样芽胞杆菌中扩增产物为SEQIDNO.3所示核苷酸序列，在苏云金芽胞杆菌中扩增产物为SEQIDNO.4所示核苷酸序列。所述的引物对如下所示：5’-AACGAAGAAGAACGCCCGTA-3’；5’-TCTTGTCTTTCGGCTCCACC-3’。本专利技术的第三个目的是提供一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以上述引物对作为扩增引物用高分辨率熔解曲线方法通过蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌不同特征性熔解曲线从而对二者进行有效区分。所述的用高分辨率熔解曲线方法，其PCR反应体系包括：2xHRMAnalysisPreMix、待测样品DNA、引物对、灭菌双蒸水。所述的PCR反应体系为：2xHRMAnalysisPreMix反应缓冲液10μL，检测样品DNA50ng，10μM上、下游引物各0.6μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。所述的用高分辨率熔解曲线方法，是在LightCycler96上采用两步法反应程序进行反应，其PCR反应程序为：95℃预变性2min，一个循环；95℃变性10s；60℃进行退火及延伸30min，共进行循环40个循环；高分辨率熔解曲线反应程序为：95℃变性1min，40℃复性1min，初始熔解温度65℃开始程序，以0.07℃/s的速率升温熔解至97℃，过程中以15Readings/℃实时监测荧光信号。本专利技术的第四个目的是提供一种准确筛选区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的新分子靶标的方法，包括如下步骤：(1)数据库中蜡样芽胞杆菌群菌株包括蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌基因组下载、去冗余和应用Prokka软件进行基因组注释；(2)蜡样芽胞杆菌群菌株基因组分类信息真实性确证分析：平均核苷酸同源性分析(averagenucleotideidentity，ANI)，以已有国际现行蜡样芽胞杆菌群或近缘物种的参考菌株作为蜡样芽胞杆菌群的标准菌株，未知菌株与标准菌株全基因组相似度进行比较分析，选用与上述标准菌株相似度最高的，初步认为未知菌株是该种；(3)蜡样芽胞杆菌群菌株基因组分类信息真实性确证分析：应用PhyloSuite软件进行核糖体蛋白多位点序列分型(rMLST)分析，提取核糖体蛋白基因并将其串联，进行最大似然树构建，以进一步确证相关菌株种属身份。(4)筛选区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的新分子靶标：对获得的身份信息真实的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌应用Roary软件进行泛基因组分析，设定阈值(Identity)为95％，选取在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分子靶标ispD作为靶标基因在区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中的应用，此应用是非疾病的治疗目的，所述的分子靶标ispD其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应蜡样芽胞杆菌，或核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，对应苏云金芽胞杆菌。/n

【技术特征摘要】
1.分子靶标ispD作为靶标基因在区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中的应用，此应用是非疾病的治疗目的，所述的分子靶标ispD其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，对应蜡样芽胞杆菌，或核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，对应苏云金芽胞杆菌。


2.一种区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的引物对，其特征在于，是根据如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列设计得到，基于HRM方法利用SNP位点对两者进行有效区分。


3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述的引物对如下所示：
5’-AACGAAGAAGAACGCCCGTA-3’；
5’-TCTTGTCTTTCGGCTCCACC-3’。


4.一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样品的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以权利要求2或3所述的引物对作为扩增引物用高分辨率熔解曲线方法通过蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌不同特征性熔解曲线从而对二者进行有效区分。


5.根据权利要求4所述的核酸检测方法，其特征在于，所述的用高分辨率熔解曲线方法，其PCR反应体系包括：2xHRMAnalysisPreMix、待测样品DNA、引物对、灭菌双蒸水。


6.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为：2xHRMAnalysisPreMix反应缓冲液10μL，检测样品DNA50ng，10μM上、下游引物各0.6μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。


7.根据权利要求4所述的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁郁，张俊卉，周桓，吴清平，王涓，朱振军，张菊梅，叶青华，陈谋通，薛亮，吴诗，曾海燕，庞锐，张淑红，杨小鹃，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44