基于LFD-RPA技术的梨火疫病菌检测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了基于LFD‑RPA技术的梨火疫病菌检测方法、试剂盒及其应用。本发明专利技术具体地公开了特异性检测梨火疫病菌的方法，所述方法包括：提取待测样品基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，用检测梨火疫病菌的组合物进行LFD‑RPA检测；根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有梨火疫病菌，所述组合物包括引物rRNA288‑F、引物rRNA288‑R和探针rRNA288‑P。本发明专利技术的检测方法快速、准确、特异性高、灵敏度高，对梨火疫病菌DNA的检测灵敏度最低限可达1.2×10

【技术实现步骤摘要】
基于LFD-RPA技术的梨火疫病菌检测方法、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及基于LFD-RPA技术的梨火疫病菌检测方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
梨火疫病是苹果、梨等多种蔷薇科植物上最具毁灭性细菌病害，主要为害植物的花、叶和嫩枝，同时也发生在果实、枝条和树干上。病害从病梢可很快扩展到枝条和树干，直至根部，一棵多年培育的梨或苹果树甚至在几星期内导致死亡。病害大流行时，可以在一到几个生长季内将整个果园毁灭。梨火疫病菌Erwiniaamylovora，属原核生物界Bacteria，变形菌门Proteobacteria，肠杆菌目Enterobacteriales，肠杆菌科Enterobacteriaceae，欧文氏菌属Erwinia。梨火疫病菌的寄主范围十分广泛，能够危害蔷薇科的多种植物，包括梨、苹果、山楂、李、栒子、唐棣等40多个属的220多种植物。梨火疫最典型的症状是植物的花、幼嫩果实和叶片受侵染后很快变成黑褐色，叶片枯萎，犹如火烧过一般，但仍挂在树上不落。根据发病部位可以将病害症状分为五种类型：(1)花簇：被侵染的花序首先变成水浸状，然后枯萎变干呈黑褐色，通常仍挂在植株上，该症状在不同寄主植物上发病程度不同。(2)枝梢和嫩枝：受侵染的枝梢和嫩枝萎蔫并变成黑褐色，通常情况下枝梢的顶端弯曲形成典型牧羊鞭状。(3)叶片：受侵染的叶片或从边缘开始形成坏死性病斑或叶柄和叶中脉变黑并逐步扩展至整个叶片。(4)果实：直接通过果皮和枝条被病原菌侵染，感染初期未成熟的果实呈水浸状，随着病程的发展逐渐变成黑褐色且皱缩，像受侵染的花一样仍挂在枝头形成干瘪的僵果。(5)树枝和树干：病原菌从受侵染的花、叶、果和枝梢侵入，通过枝条蔓延至大的树枝和树干并引起溃疡。溃疡部位周围的树皮首先呈水浸状，随后干缩下陷。溃疡部树皮通常表面光滑，有时呈紫色，但溃疡下部的木质部通常有红褐色条纹，在侵染部位常可见琥珀色汁液流出。根据EPPO数据显示，截至2020年底，梨火疫病在美洲、欧洲、非洲、亚洲以及大洋洲多个国家均有发生报道，属于特高风险有害生物，因此，为了保护我国相关产业安全，防止有害生物的传入和疫情扩散，亟需建立一套快速、准确、特异、灵敏的分子检测方法，为进口检疫提供可靠、有效的技术保障。重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)是Piepenburg等人在2006年提出的一种新型多酶恒温核酸扩增技术，可以快速且便捷地进行核酸检测分析。能在25℃-43℃的恒温条件下实现特定核酸序列的扩增，并在5-20min内观察结果。RPA的整个反应体系包括了噬菌体重组酶、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、单链核酸结合蛋白、DNA模板、Mg2+和辅助因子等。其反应原理主要是在25-43℃的恒温条件下，重组酶和寡核苷酸引物结合形成蛋白/单链核苷酸的复合体，在辅助蛋白和单链核酸结合蛋白的帮助下侵入双链DNA；待找到与引物互补的目的区域后，寡核苷酸引物与同源序列发生链交换反应形成D环结构，单链核酸结合蛋白随即与被置换的DNA链相结合以防止引物解离；复合体解体后引物3’端暴露出来并被DNA聚合酶识别，在聚合酶的作用下启动扩增反应，上下游同时反应形成完整的扩增子。重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(LFD-RPA)是RPA技术结合侧流层析试纸条(lateralflowdipsticks，LFD)建立的一种现场快速检测(point-of-caretesting，POCT)系统。在RPA基础反应体系中，用5’端带有生物素标记的下游引物和带有6-FAM标记的探针对靶核酸进行扩增反应，使得扩增产物既被生物素标记又带有FAM基团。试纸条的检测线上带有生物素抗体和带有FAM抗体的纳米金粒，将待检测的产物加到试纸条上，产物上的FAM基团和FAM抗体发生反应，检测线上的生物素抗体也会和产物上的生物素相结合，捕获到特异性扩增产物的试纸条检测线上显示出红色条带，最终实现检测结果可视化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何方便、快速和/或灵敏地检测梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了检测梨火疫病菌的方法，包括以下步骤：B1)提取待测样品基因组DNA；B2)以所述基因组DNA为模板，用检测梨火疫病菌的组合物进行LFD-RPA检测；根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有梨火疫病菌，所述组合物包括引物rRNA288-F、引物rRNA288-R和探针rRNA288-P；所述引物rRNA288-F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述引物rRNA288-R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针rRNA288-P的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。所述引物rRNA288-F为正向引物；所述引物rRNA288-R为反向引物。上述方法中，根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有梨火疫病菌的方法为：如果LFD试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明待测样品中含有梨火疫病菌；如果LFD试纸条只出现一条红色条带，位于质控区内，则结果为阴性，表明待测样品中不含有梨火疫病菌。所述位于质控区内的红色条带为质控线(C线)；所述位于检测区内的红色条带为检测线(T线)。上述方法中，步骤B2)所述LFD-RPA检测的反应体系(共50uL)为：10umol/L的上游引物rRNA288-F2uL；10umol/L的下游引物rRNA288-F2uL；10umol/L的探针rRNA288-P0.6uL；Abuffer(水化缓冲液)29.4uL；ddH2011.5uL；加入一管预混有核酸外切酶、重组酶、聚合酶以及单链结合蛋白的冻干粉中，充分混匀后加入2uL模板，于管壁上加入2.5uLBbuffer(280mmol/L醋酸镁)。进一步地，所述反应体系经过短时间的涡旋振荡混匀后，将反应液甩至管底部，然后立即将反应管放入金属浴中39℃孵育10min；反应结束后将未开盖的反应管放于检测装置(LFD测流层析胶体金试纸条)中，向下按压装置外壳直至其闭合，室温放置十分钟后观察质控线和检测线判读结果。上述方法中，所述引物rRNA288-R的5’端用生物素标记。上述方法中，所述探针rRNA288-P的5’端标记荧光基团、距5’端31位碱基和32位碱基中间用四氢呋喃修饰以及3’端标记C3-spacer。所述荧光基团可为FAM、FITC、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3、JOE、TexasRed、LCRED640或LCRED705中的任一种。进一步地，上述方法中，所述荧光基团为FAM。本专利技术还提供了检测梨火疫病菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述组合物和LFD试纸。本专利技术还提供了检测梨火疫病菌的组合物。所述组合物为用于检测梨火疫病菌的LFD-RPA可视化检测组合物。本专利技术还提供了所述试剂盒在梨火疫病菌的检测或辅助检测中的应用。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测梨火疫病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nB1)提取待测样品基因组DNA；/nB2)以所述基因组DNA为模板，用检测梨火疫病菌的组合物进行LFD-RPA检测；根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有梨火疫病菌，所述组合物包括引物rRNA288-F、引物rRNA288-R和探针rRNA288-P；所述引物rRNA288-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物rRNA288-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针rRNA288-P的核苷酸序列如SEQID No.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.检测梨火疫病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
B1)提取待测样品基因组DNA；
B2)以所述基因组DNA为模板，用检测梨火疫病菌的组合物进行LFD-RPA检测；根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有梨火疫病菌，所述组合物包括引物rRNA288-F、引物rRNA288-R和探针rRNA288-P；所述引物rRNA288-F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述引物rRNA288-R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针rRNA288-P的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有梨火疫病菌的方法为：如果LFD试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明待测样品中含有梨火疫病菌；如果LFD试纸条只出现一条红色条带，位于质控区内，则结果为阴性，表明待测样品中不含有梨火疫病菌。

【专利技术属性】
技术研发人员：田茜，赵文军，张瑾逸，张王斌，胡白石，罗来鑫，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11