检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQID NO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的引物对和探针。本发明专利技术的检测结核分支杆菌的试剂盒，基于巢式RPA检测技术(nestRPA)，最低可检出1拷贝/uL的结核分支杆菌核酸片段，具有超高灵敏度，且无需昂贵检测设备，检测时间短，最短仅需15分钟，该技术有利于早期发现感染结核分支杆菌人群，为感染结核分支杆菌人群的早期隔离和早期治疗提供新的技术支撑，具有非常好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种基于巢式RPA(nestRPA)技术检测结核分支杆菌IS6110基因的引物对、探针、试剂盒及其应用。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。排菌者为其重要的传染源。人体感染结核菌后不一定发病，当抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，才可能引起临床发病。若能及时诊断，并给予合理治疗，大多可获临床痊愈。结核菌属于放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，为有致病力的耐酸菌。主要分为人、牛、鸟、鼠等型。对人有致病性的主要是人型菌，牛型菌少有感染。1882年，德国细菌学家郭霍(RobertKoch，1843-1910)首先发现并证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。结核病临床特征为：有较密切的结核病接触史，起病可急可缓，多为低热(午后为著)、盗汗、乏力、纳差、消瘦、女性月经失调等；呼吸道症状有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难。结核分枝杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。结核病严重影响人类健康和生命，人类与之斗争了许多世纪。在17-18世纪的欧洲，结核病被称为"白色瘟疫"，几乎100％的欧洲人被感染，25％的欧洲人死亡。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪90年代以来，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。结核病成为首要的再现传染病，成为了全球尤其是发展中国家最为严重的全球性卫生问题。全世界约有1/3的人感染结核分枝杆菌，每年有900万的新病例出现，有200万人死于该疾病。中国是结核病高负担国家，发病率仅次于印度。国内带菌人群多，发病人群多，死亡人群多。2018年，我国肺结核发病人数88.9万人，死亡人数3149人。2019年，我国肺结核的发病人数为96.31万人，死亡人数为2008人。目前临床诊断方法一般为：痰涂片、结核菌素试验、特异性抗体测定(酶联吸附试验)、胸腔积液检查及影像学检查，结核菌聚合酶联反应(PCR)阳性有辅助诊断价值。目前临床分子诊断技术主要分为：蛋白检测和核酸检测，例如：LAM抗原检测、XpertqPCR核酸扩增法、核酸扩增和杂交、LAMP-PCR核酸扩增法。这些方法都具有各自的优缺点。其中，这些技术应用于结核分枝杆菌的检测时，仍然存在因灵敏度偏低，而造成结果假阴性的问题。此外，临床发现有30％左右的患者没有痰液或痰液很少，无法使用痰培养分离结核菌技术进行临床诊断；同时，即使有痰液的患者可以进行痰培养，其中仍有很大比例痰培养为阴性结果，而且痰培养的时间太长。因此，痰培养无法做到快速准确地诊断结核病。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行特异性扩增，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(37℃-42℃，5-30min)，大大缩短了检测时间。RPA为核心的等温核酸扩增技术，减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可进行样本检测工作，利用荧光分析装置实时判断是否存在待扩增的产物，对实验设施和操作设备要求低的特点。近年来，已广泛应用于生命科学研究、医学检测、农业、食品安全、转基因检测等多个领域。目前，结核病仍是全世界最严重的传染病之一，潜伏性结核分支杆菌感染者为数众多，是潜在的传染源，危害巨大；而目前的检测技术手段仍存在一定的漏检率和假阴性率，早期、准确地发现结核分枝杆菌感染者是一个亟待解决的问题，因此急需开发出具有高灵敏度和快速准确的结核分支杆菌核酸检测新技术。
技术实现思路
本专利技术要解决目前缺乏高灵敏度的检测结核分支杆菌试剂盒的技术问题，提供一种基于巢式RPA(nestRPA)技术检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒，该试剂盒能快速、准确、灵敏、特异地对结核分支杆菌进行检测，从而减少结合病的漏检率和假阴性率。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种检测结核分支杆菌的引物对，所述引物对是针对SEQIDNO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的引物对。优选的，所述引物对是以巢式RPA检测结核分支杆菌的引物对，其包含外引物对和内引物对。更优选的，所述外引物对具有如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的碱基序列，所述内引物对具有如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的碱基序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种检测结核分支杆菌的探针，所述探针是特异性针对SEQIDNO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的探针。优选的，所述探针具有如SEQIDNO：2所示的碱基序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种检测结核分支杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。优选的，所述试剂盒还包含上述探针。在本专利技术的另一方面，还提供了一种以巢式RPA检测结核分支杆菌的方法，包括以下步骤：用针对结核分支杆菌IS6110基因的一对外引物，以待测样本核酸为模板进行第一次RPA反应，扩增目的基因第一片段；用针对结核分支杆菌IS6110基因的一对内引物，以扩增出的目的基因第一片段为模板、并在加入结核分支杆菌IS6110基因特异性信号探针的条件下进行第二次RPA反应，扩增目的基因第二片段；通过检测探针信号，获得结核分支杆菌核酸的检测结果。所述信号探针为荧光素标记的探针，所述检测探针信号是利用荧光检测设备检测标记在探针上的荧光素信号。在本专利技术的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测结核分支杆菌的产品中的应用。本专利技术检测结核分支杆菌的试剂盒，通过nestRPA技术检测结核分支杆菌IS6110基因，最低可检测到1拷贝/uL的结核分支杆菌核酸片段，大大提高了检测灵敏度，且在39℃恒温条件下进行检测反应，无需昂贵检测设备，检测时间短，仅需15min，该技术可早发现感染结核分支杆菌人群，为早期隔离和早期治疗提供新的技术支撑，具有非常好的应用前景。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1的RPA检测IS6110基因优选引物LOD结果图；图2是本专利技术实施例2的nestRPA检测IS6110基因(阳性质粒)LOD结果图；图3是本专利技术实施例3的使用nestRPA对结核分枝杆菌H37Ra菌株DNA的检测能力结果图；图4是本专利技术实施例4的利用nestRPA方法对IS6110基因优选引物和探针组合的特异性检测结果图；图5是本专利技术实施例5的利用nestRPA方法对临床样本IS6110基因检测结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测结核分支杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对是针对SEQ ID NO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的引物对。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测结核分支杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对是针对SEQIDNO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的引物对。


2.根据权利要求1所述的检测结核分支杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对是以巢式RPA检测结核分支杆菌的引物对，其包含外引物对和内引物对。


3.根据权利要求2所述的检测结核分支杆菌的引物对，其特征在于，所述外引物对具有如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的碱基序列，所述内引物对具有如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的碱基序列。


4.一种检测结核分支杆菌的探针，其特征在于，所述探针是特异性针对SEQIDNO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的探针。


5.根据权利要求4所述的检测结核分支杆菌的探针，其特征在于，所述探针具有如SEQIDNO：2所示的碱基序列。


6.一种检测结核分支杆菌的试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄婉秋，黄健，
申请(专利权)人：黄婉秋，黄健，
类型：发明
国别省市：上海;31