利用肠道细菌检测早期肺癌制造技术

本发明专利技术提供通过检测消化道样品中的细菌来诊断肺癌的试剂、方法及其用途。

【技术实现步骤摘要】
利用肠道细菌检测早期肺癌
本专利技术涉及利用肠道菌群预测早期肺癌的领域。
技术介绍
肺癌是指肺的恶性上皮性肿瘤，起源于支气管上皮、支气管腺体、细支气管上皮和肺泡上皮。因为正常呼吸道上皮细胞类型多，在肿瘤的发生发展过程中，多能干细胞可以向不同方向分化，导致肺癌在组织学上的异质性，所以肺癌组织形态较复杂。目前国内外将肺癌分为两大类-小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。其中，临床诊断出的绝大部分肺癌属于NSCLC，而NSCLC按照组织分类可分为腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)以及大细胞癌(LCC)。肺癌是当今世界发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤。近几十年来，其发病率随着工业发展、环境污染，以及人类生活方式改变等因素一直保持上升的趋势。虽然肺癌的诊疗技术随着科技发展已经有了显著进步，但由于缺乏早期诊断方法和敏感、特异的筛查指标，肺癌的死亡率仍然很高。早期肺癌患者手术后5年生存率可达70％以上，而中晚期肺癌患者的5年生存率仅为20％左右。因此肺癌的早期诊断及治疗是改善其预后的关键，开发早期诊断方法和敏感、无创的筛查指标是亟待解决的问题。针对肺癌诊断的方法，目前应用较多的是胸部X射线检测、低剂量螺旋CT(LDSCT)检测、支气管镜检查、血清中肿瘤标志物检测和正在兴期的分子生物标志物检测。胸部X光片是诊断肺部疾病的重要手段，通过胸片可以看到全部的胸部结构，但是由于组织之间出现互相重叠的现象致使某些区域的病变并不能清晰的显示出来，而且胸片分辨率相对较低，使得其对小病灶或是隐蔽区的病灶不够敏感，而LDSCT相对于胸部X光片有更高的分辨率，能检测出胸片无法检出的肺部小结节和早期肺癌(≤30mm)，但作为肺癌诊断的一种手段，LDSCT的成本较高，而且可能出现过度诊断的问题。统计学调查表明，CT检测出来的结节有很大一部分为良性结节，且部分患者在接收LDSCT检测之后进行了后续的有创检查而没有发现肺癌。近几年发展迅速的支气管镜技术可以提高中央及周围型肺癌的早期诊断率，但是这一技术操作复杂、花费较大，目前仍处于实验阶段，还未广泛应用于临床。研究人员目前已发现数十种与肺癌相关的肿瘤标志物，例如标志物CEA(癌胚抗原)、CA199(糖类抗原19-9)、CA125(糖类抗原125)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、CTFRA21-1(细胞角蛋白19片段)等，但是尚未发现一种灵敏度及特异性均高的肿瘤标志物。研究人员发现只有联合使用多种标志物才可以将肺癌检测的敏感性和准确度提高到82％和91％。因此，肿瘤标记物的单项检测对肺癌的早期诊断具有一定的局限性。随着基因检测技术的发展，FHIT基因的缺失、p16基因甲基化、miRNAs表达及端粒酶等分子生物标志物的研究正在逐步被深入研究和应用，可能将肺癌的早期诊断提高到一个新的水平，但还需要在组织样本与大规模人群中验证。血清肿瘤标志物和分子生物标记物的大规模研究应用提示我们操作简单、无创是近年来肺癌早期诊断研究的热点。大量的微生物栖息在人体肠道内，微生物种类超过1000种，其细胞数量高达1014，为机体细胞总数的10倍，共包含100多万个基因，被称为“人体的第二基因组”。肠道菌群主要包括拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)两个优势菌门。在属(Genus)水平上，拟杆菌(Bacteroid)、柔嫩梭菌(Clostridiumtende)、乳酸菌(Lactobacillus)以及双歧杆菌(Bifidobacterium)是四类与人体健康密切相关的优势菌。各类细菌在肠道内保持共生或拮抗关系，共同形成一个动态平衡的微生态系统，参与调控机体生理功能。各类细菌在肠道内保持共生或拮抗关系，共同形成一个动态平衡的微生态系统，参与调控机体生理功能。肠道菌群的主要作用包括：(1)维持肠粘膜屏障；(2)参与免疫系统的建立及免疫调节；(3)合成重要维生素；(4)通过竞争性摄取营养物质或分泌细菌素，阻止潜在致病菌在肠道定植；(5)利用低聚糖等消化碳水化合物发酵产生短链脂肪酸(short-chainfattyacids，SCFAs)，为肠粘膜细胞提供能量，并起到抗炎症、抗肿瘤等作用。近年来研究发现，肠道菌群通过其代谢产物能够直接介入宿主的代谢及重要化学物质转化过程。Bischoff于2014年提出“肠道健康(guthealth)”的概念：肠道健康的人没有肠胃症状主诉，没有发生肠道疾病的危险因素以及胃肠疾病的发生。肠道健康主要包括两个重要内容，即肠道菌群健康和肠粘膜屏障健康。如果肠道菌群在丰度、多样性、稳定性等方面发生改变，称为肠道紊乱(microbialdysbiosis)。目前许多研究结果表明，多种肠内疾病(如炎症性肠病、结肠癌、伪膜性肠炎等)，肠外疾病(如皮疹、哮喘、肥胖、糖尿病、自身免疫性疾病、乳腺癌、子宫内膜癌等)均与肠道菌群紊乱相关。人体的呼吸道与外界相通，是微生物的重要栖息地。Hilty等研究人员于2010年发现肺部存在着多种微生物群落。随后研究发现，肺囊性纤维化和哮喘患者的呼吸道特异微生物发生显著改变，表明呼吸道菌群改变可以引起肺部疾病，但是肠道菌群与肺部疾病甚至肺癌的研究还鲜有报道。
技术实现思路
本研究通过收集上海肺科医院96例经病理初次确诊的肺癌患者新鲜粪便，作为肺癌组；筛选年龄、性别、BMI等因素相匹配的101例健康人，收集其新鲜粪便，作为对照组。其中54例肺癌患者和71例健康人样本作为训练集(Discoverycohort)，通过16sRNA多样性测序方法分析两组之间肠道菌群的差异，从中找出特异微生物用于诊断肺癌，剩余样本作为验证集(Validationcohort)检测标志物对肺癌的预测效果。本研究从微生态学角度分析肺癌的发病因素及可能的发病机制，通过筛选特异改变的菌群集合来预测肺癌发生的几率，为肺癌的诊断、预防和治疗提供新策略。因此，本文第一方面提供一种肺癌诊断方法，所述方法包括检测来自消化道的样品中选自以下目中一目或多目的细菌的存在量的步骤：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales。在某些实施方案中，检测来自消化道的样品中选自以下目中至少1目、至少2目、至少3目、至少4目或全部5目的细菌的存在量：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales目细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales和Lactobacillales目细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales、Lactobacillales和Bacteroidales目细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales和Clostridiales目细菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.消化道细菌16S rRNA或其片段和/或所述消化道细菌16S rRNA或其片段的检测试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，/n其中，所述试剂盒还包括定量检测消化道细菌存在量的定量试剂，所述消化道细菌选自：/n以下目中两目或更多目的细菌：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales，或/n以下科中两科或多科的细菌：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales，和任选的unclassified_o__Clostridiales，或/n以下属中两属或多属的细菌：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus，或/n以下种中一种或多种的细菌：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacteriumlongum、Roseburia faecis和Ruminococcus bromii，和任选的Blautia obeum、和Bacteroides ovatus，或/n以下OTU中一个或多个OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094，/n优选地，所述消化道细菌选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954，和任选的选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094，/n优选地，所述16S rRNA的片段为V3和V4可变区；/n优选地，所述检测试剂为扩增所述16S rRNA或其片段的引物和任选的与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针；更优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO:28和29所示，/n优选地，所述定量试剂检测消化道细菌16S rRNA或其片段的存在量；更优选地，所述定量试剂为所述16S rRNA或其片段的DNA测序引物或与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。/n...

【技术特征摘要】
1.消化道细菌16SrRNA或其片段和/或所述消化道细菌16SrRNA或其片段的检测试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，
其中，所述试剂盒还包括定量检测消化道细菌存在量的定量试剂，所述消化道细菌选自：
以下目中两目或更多目的细菌：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales，或
以下科中两科或多科的细菌：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales，和任选的unclassified_o__Clostridiales，或
以下属中两属或多属的细菌：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus，或
以下种中一种或多种的细菌：Faecalibacteriumprausnitzii、Bifidobacteriumlongum、Roseburiafaecis和Ruminococcusbromii，和任选的Blautiaobeum、和Bacteroidesovatus，或
以下OTU中一个或多个OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094，
优选地，所述消化道细菌选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954，和任选的选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094，
优选地，所述16SrRNA的片段为V3和V4可变区；
优选地，所述检测试剂为扩增所述16SrRNA或其片段的引物和任选的与所述16SrRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针；更优选地，所述引物的序列如SEQIDNO:28和29所示，
优选地，所述定量试剂检测消化道细菌16SrRNA或其片段的存在量；更优选地，所述定量试剂为所述16SrRNA或其片段的DNA测序引物或与所述16SrRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。


2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述16SrRNA的片段具有选自SEQIDNO:1-27中的一个或多个的序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，
更优选地，所述16SrRNA的片段具有选自SEQIDNO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQIDNO:3所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQIDNO:25所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的选自SEQIDNO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体。


3.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其特征在于，所述消化道是肠道，优选地，所述消化道细菌来自粪便。


4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括消化道细菌16SrRNA或其片段和/或所述消化道细菌16SrRNA或其片段的检测试剂，和定量检测消化道细菌存在量的定量试剂，和任选的PCR扩增所需试剂和/或定量检测所需试剂，
其中，所述消化道细菌选自：
以下目中两目或更多目的细菌：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales，或
以下科中两科或多科的细菌：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales，和任选的unclassified_o__Clostridiales，或
以下属中两属或多属的细菌：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus，或
以下种中一种或多种的细菌：Faecalibacteriumprausnitzii、Bifidobacteriumlongum、Roseburiafaecis和Ruminococcusbromii，和任选的Blautiaobeum、和Bacteroidesovatus，或
以下OTU中一个或多个OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094，
优选地，所述消化道细菌选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954，和任选的选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094，
优选地，所述16SrRNA的片段为V3和V4可变区；
优选地，所述检测试剂为扩增所述16SrRNA或其片段的引物和任选的与所述16SrRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针；更优选地，所述引物的序列如SEQIDNO:28和29所示，
优选地，所述定量试剂检测消化道细菌16SrRNA或其片段，更优选地，所述定量试剂为所述16SrRNA或其片段的DNA测序引物或与所述16SrRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述16SrRNA的片段具有选自SEQIDNO:1-27中的一个或多个的序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，
更优选地，所述16SrRNA的片段具有选自SEQIDNO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQIDNO:3所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQIDNO:25所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的选自SEQIDNO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列或与...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈剑峰，季红斌，郑雅娟，方兆元，张箭，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：上海;31