过表达虫草素的重组蛹虫草制造技术

本发明专利技术提供一种过表达虫草素的重组蛹虫草，所述过表达虫草素的重组蛹虫草是将目的基因导入蛹虫草细胞中构建而成；所述目的基因为腺苷琥珀酸合酶基因、腺苷琥珀酸裂合酶基因或5’‑核苷酸酶基因。通过基因工程手段构建了能够稳定遗传并过表达的蛹虫草的突变菌株，该突变菌株与野生型菌株相比，其发酵液中的胞外虫草素产量为1.63倍，胞内虫草素含量为2.61倍，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下基础。

【技术实现步骤摘要】
过表达虫草素的重组蛹虫草
本专利技术属于蛹虫草栽培领域，主要涉及一种过表达虫草素的重组蛹虫草。
技术介绍
蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草，为子囊菌门，肉座目，麦角菌科、虫草属真菌，由子座(子实体)和菌核组成的复合体。蛹虫草富含多种活性化合物，其中包括1)核苷类，如虫草素、腺苷、腺嘌呤和次黄嘌呤等；2)虫草多糖；3)虫草甾醇和糖醇类物质，如虫草酸(又名D-甘露醇)、麦角甾醇和胆固醇等；4)酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)纤维蛋白溶解酶和溶栓酶等等，现广泛应用于医药行业。虫草素(Cordycepin)是蛹虫草的主要活性成分之一，最早从蛹虫草中提取，随后在冬虫夏草(Cordycepssinensis)和九州虫草(Cordycepskyushuensis)也被发现有该种化合物。虫草素具有抗肿瘤，对大多数癌细胞均具有明显的抑制作用甚至促使其凋亡。因此，虫草素可用于抗肿瘤药物的开发，且虫草素安全性能高。虫草素作为核苷酸类物质，对细菌、真菌、病毒等微生物的代谢有多重作用。有研究表明虫草素对真菌、细菌有抑制作用，对病毒有杀伤抑制作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过表达虫草素的重组蛹虫草，其特征在于：所述过表达虫草素的重组蛹虫草是将目的基因导入蛹虫草细胞中构建而成；所述目的基因为腺苷琥珀酸合酶基因、腺苷琥珀酸裂合酶基因或5’-核苷酸酶基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种过表达虫草素的重组蛹虫草，其特征在于：所述过表达虫草素的重组蛹虫草是将目的基因导入蛹虫草细胞中构建而成；所述目的基因为腺苷琥珀酸合酶基因、腺苷琥珀酸裂合酶基因或5’-核苷酸酶基因。


2.一种过表达虫草素的重组蛹虫草，其特征在于所述过表达虫草素的重组蛹虫草按以下方法构建：
(1)将目的基因与线性化双元载体pCAMBIA0380连接，得到重组载体；用所述重组载体转化根癌农杆菌，通过含25μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基培养并筛选，获得含重组载体的根癌农杆菌菌株；
(2)将步骤(1)得到的所述含重组载体的根癌农杆菌菌株含200μmol/L乙酰丁香酮的IM培养基诱导培养后，与野生型蛹虫草孢子(Cordycepsmilitaris)共培养，用含200μg/mL潮霉素、50μg/mL卡那霉素和100μg/mL头孢菌素的IM培养基筛选，再在含200μg/mL潮霉素的PDA培养基上连续传代五次,得到所述的过表达虫草素的重组蛹虫草。


3.如权利要求1所述的过表达虫草素的重组蛹虫草，其特征在于：所述腺苷琥珀酸合酶基因的基因符号为CCM_06768,核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述腺苷琥珀酸裂合酶基因的基因符号为CCM_05789，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述5’-核苷酸酶基因的基因符号为CCM_02831，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


4.如权利要求1所述的过表达虫草素的重组蛹虫草，其特征在于：所述目的基因利用PCR扩增从蛹虫草菌丝中得到，所述蛹虫草菌丝为CordycepsmilitarisCGMCC3.14242。


5.如权利要求4所述的过表达虫草素的重组蛹虫草，其特征在于：所述目的基因为腺苷琥珀酸合酶基因时，所述PCR扩增中使用的引物对是CCM_06768-FGCAGACATCACAATGAGTATTACAGTCATTCTCGGCTCCC；CCM_06768-RTTTCGCCACGGAGCTTTACCGGTAAATCATGTCGTCGCGT；
所述目的基因为腺苷琥珀酸裂合酶基因时，所述PCR扩增中使用的引物对是CCM_05789-FGCAGACA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈萍，杨胜利，季小康，孔潇慧，王逸峰，徐德，徐晓倩，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33